陶星茹，劉珂娣，趙石，李偉紅，陳海霞，2，董泰瑋，衛(wèi)培峰，段佳林，奚苗苗，5*（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 72046；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 7002；.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，陜西 咸陽(yáng) 72000；4.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院，西安 70072；5.西安天工生物醫(yī)藥研究所，西安 7002）

腦卒中在全球范圍已成為僅次于心血管疾病和癌癥的第三大致死病因，其發(fā)病率、致殘率、死亡率及復(fù)發(fā)率持續(xù)上升，嚴(yán)重危害人類健康[1]。腦卒中主要分為缺血性腦卒中（IS）和出血性腦卒中，缺血性腦卒中占臨床病例的70%～80%[2]。臨床上對(duì)于缺血性腦卒中的有效治療藥物只有重組組織型纖溶酶原激活劑（rt-PA），但由于治療時(shí)間窗的限制，大多數(shù)患者無(wú)法得到及時(shí)有效的治療[3-6]。研究顯示，恢復(fù)缺血半暗帶血流量，恢復(fù)血供及氧供，促進(jìn)血管新生，增加腦組織缺血區(qū)氧供，可以挽救缺血導(dǎo)致的組織損傷，進(jìn)而改善神經(jīng)功能[7]。 中藥太白楤木是五加科楤木屬（Aralia）的落葉灌木或小喬木，太白楤木皂苷（saponins fromAralia Taibaiensis，sAT）提取自太白楤木根皮，具有心腦血管保護(hù)、降血脂、降血糖等藥理作用[8]。課題組前期研究結(jié)果表明，太白楤木皂苷可降低大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠腦梗死體積，改善MCAO大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。但是，sAT治療IS的藥效物質(zhì)、生物過(guò)程及分子機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)廣泛用于中藥藥效物質(zhì)及作用機(jī)制的研究，與中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的思想相契合，同時(shí)與中藥多途徑、多靶標(biāo)的治療原理一致[10]，分子對(duì)接技術(shù)廣泛用于中藥及中藥復(fù)方作用藥效物質(zhì)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證[11]，因此，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略，尋找 sAT治療IS的藥效物質(zhì)，揭示sAT治療IS的生物學(xué)過(guò)程及分子機(jī)制，并通過(guò)半柔性對(duì)接方法及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型為IS研究的常用細(xì)胞模型[12]，氧糖剝奪模擬腦缺血病程，復(fù)氧復(fù)糖模擬再灌注病程，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）是用于研究血管新生的經(jīng)典細(xì)胞[13]，因此，本研究構(gòu)建HUVECs OGD/R模型，闡明sAT促進(jìn)血管新生治療IS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和具體作用機(jī)制，為sAT的臨床應(yīng)用及二次開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

371型CO2培養(yǎng)箱（美 國(guó)Thermo公 司），YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），MultiskanSky型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司），BSC-1100ⅡA2-X型生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司），TD4型臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），BSA124S型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，THZ-100型恒溫?fù)u床（上海一恒儀器有限公司），QL901型渦旋儀（海門(mén)市其林貝爾儀器有限公司），電泳儀（北京凱元信瑞儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

1.2 試藥

去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品（辰光生物科技有限公司，批號(hào)：26020-14-4，純度＞98%）；胎牛血清（FBS，以色列BI公司，批號(hào)：1928625）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號(hào)：20210331）、胰蛋白酶消化液（批號(hào)：CR2103040）、杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS，pH 7.4，批號(hào)：21031022）（武漢塞維爾生物科技有限公司）；DMEM/F-12高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Corning公司，批號(hào)：10092013）；DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)：MA0582-Jul-03F）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)MP公司，批號(hào)：Y181007）；CCK-8試劑盒（蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：70120258）；人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊特生物科技有限公司，批號(hào)：VIXCFZ2X4W）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：BG1103）；VEGF抗體（Servicebio，批 號(hào)：AC2102017D）；GAPDH抗 體（Servicebio，批號(hào)：LS194236）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格；水為超純水。

1.3 細(xì)胞

HUVECs由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科贈(zèng)予。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 sAT化學(xué)成分收集及其治療IS的靶標(biāo)獲取 通過(guò)查閱中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）及PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，全面收集sAT化學(xué)成分，并對(duì)sAT化學(xué)成分治療所有疾病的靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中以“stroke”為關(guān)鍵詞，在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以“stroke”“cerebral infarction”和“middle cerebral artery”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得的靶標(biāo)取與sAT化學(xué)成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)的交集，即sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)。將獲得的靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人類，置信分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.400，獲得各靶標(biāo)互作信息。

2.1.2 sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)的GO富集分析及KEGG富集分析 將獲得的sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，以“P＜0.05”為篩選條件，對(duì)sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析。以“P＜0.05”及“count≥5”為篩選條件，對(duì)sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2.1.3 核心靶標(biāo)預(yù)測(cè) 核心靶標(biāo)是基于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)得到的，在信號(hào)通路中具有重要調(diào)控作用的靶標(biāo)。最大團(tuán)體中心性算法（maximal clique centrality，MCC）能夠從網(wǎng)絡(luò)中的高連接度靶標(biāo)與低連接度靶標(biāo)中捕獲到網(wǎng)絡(luò)中的核心靶標(biāo)，MCC值越大代表靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中越重要[14]。故本研究將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的靶標(biāo)互作信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.6軟件中，采用CytoHubba插件中的MCC算法，篩選sAT化學(xué)成分治療IS的核心靶標(biāo)。

2.2 分子對(duì)接驗(yàn)證

將sAT化學(xué)成分與部分核心靶標(biāo)進(jìn)行半柔性對(duì)接，以探究sAT化學(xué)成分治療IS的分子機(jī)制。靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)全部來(lái)源于RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/），選取結(jié)構(gòu)相似且分辨率較高的人源受體晶體結(jié)構(gòu)[15]。利用ChemBio Draw Ultra14.0繪制sAT化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)并保存為Mol2格式。運(yùn)行Autodock Vina程序?qū)觼?lái)驗(yàn)證sAT化學(xué)成分與部分核心靶標(biāo)的結(jié)合效果，根據(jù)結(jié)合能小于－7.0 kcal·mol－1篩選得到潛在的藥效物質(zhì)[16]，并用Discovery Studio軟件對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行可視化。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs使用完全培養(yǎng)基（即含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM/F-12高糖培養(yǎng)基），置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2日更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代。

2.3.2 細(xì)胞分組及造模 將HUVECs分為6組，正常組：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；OGD/R模型組：給予DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基放于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，取出換成含藥的完全培養(yǎng)基放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；溶劑組：給予DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基放于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，再換成含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa低、中、高劑量組：給予DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基放于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，再取出換成含10、20、40 μmol·L－1去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa（溶劑為0.1%DMSO，濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的完全培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 以5×104個(gè)/孔將HUVECs接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組處理，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞和藥物的空白對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。造模給藥完成后，更換含10%CCK-8液的完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.4 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞VEGF水平 以2×105個(gè)/孔將HUVECs接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。造模給藥完成后，細(xì)胞消化離心后，加入300 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液放于冰上裂解，離心，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá) 以5×105個(gè)/孔將HUVECs接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組處理。造模給藥完成后細(xì)胞消化離心，每管加入400 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液放于冰上裂解，離心，取上清液，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液試劑后，加熱變性。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)（20 μg），電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶在TBST緩沖液中室溫下封閉2 h，隨后加入VEGF及GAPDH抗體，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜30 min后，加入二抗羊抗兔IgG孵育2 h后，再用TBST緩沖液洗膜30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)成像并用Lane 1D軟件進(jìn)行蛋白半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 sAT的化學(xué)成分收集與靶標(biāo)預(yù)測(cè)

從CNKI及PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的文獻(xiàn)中共收集31個(gè)sAT化學(xué)成分（見(jiàn)表1）。對(duì)31種化學(xué)成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的靶標(biāo)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)，限定研究物種為人類，進(jìn)行校正和剔重，共獲得416個(gè)靶標(biāo)。

表1 sAT中31種化學(xué)成分的基本信息 Tab 1 Basic information of the 31 ingredients from sAT

3.2 IS發(fā)病機(jī)制靶標(biāo)收集及sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)獲取

通過(guò)CTD、GeneCards、OMIM 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得383個(gè)無(wú)重復(fù)的IS發(fā)病機(jī)制相關(guān)靶標(biāo)。將sAT中31個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的416個(gè)預(yù)測(cè)靶標(biāo)與IS相關(guān)的383個(gè)靶標(biāo)導(dǎo)入Venn在線繪圖工具，取交集共獲取71個(gè)共同靶標(biāo)即sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)，其Uniprot ID、蛋白質(zhì)及基因名信息見(jiàn)表2。

表2 71個(gè)sAT化學(xué)成分治療IS靶標(biāo)的基本信息 Tab 2 Basic information of 71 targets from sAT for IS

3.3 sAT化學(xué)成分治療IS靶標(biāo)的GO及KEGG富集分析

對(duì)71個(gè)sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共得到241個(gè)生物過(guò)程（BPs）、30個(gè)細(xì)胞成分（CCs）與66個(gè)分子功能（MFs）。富集的生物過(guò)程結(jié)果表明，sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)主要參與凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、缺少配體的外源性凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞增殖的正向調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)正向調(diào)控、細(xì)胞遷移正向調(diào)控、血管生成正向調(diào)控；富集的細(xì)胞成分結(jié)果表明，sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)主要分布在細(xì)胞外間隙、細(xì)胞膜、膜筏、細(xì)胞外區(qū)域、胞漿；富集的分子功能結(jié)果表明，sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)主要參與酶結(jié)合位點(diǎn)、絲氨酸型酶內(nèi)切酶活性、蛋白結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。

對(duì)71個(gè)sAT化學(xué)成分治療IS的靶標(biāo)進(jìn)行KEGG富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共得到104條KEGG通路，根據(jù)count值≥5篩選與IS相關(guān)的前20條信號(hào)通路，結(jié)果表明，sAT化學(xué)成分主要通過(guò)黏著斑、PI3K-Akt、HIF-1、VEGF、Toll樣受體、凋亡等信號(hào)通路治療IS（見(jiàn)表3）。

表3 71個(gè)sAT化學(xué)成分治療IS靶標(biāo)涉及的生物過(guò)程、信號(hào)通路以及參與調(diào)控的核心靶標(biāo) Tab 3 Target of 71 sAT ingredients for IS included biological process，signaling pathway，and core target involved in regulation

3.4 核心靶標(biāo)預(yù)測(cè)

STRING中保存獲得的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)作為T(mén)SV文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.6軟件。利用CytoHubba插件篩選得到前20個(gè)核心靶標(biāo)，即TNF、CASP3、VEGFA、PTGS2、EGFR、JUN、STAT3、MAPK1、MMP9、MMP2、ESR1、MAPK8、MAPK14、FGF2、IL1B、MMP3、MMP1、PLG、BCL2L1、CASP8。

3.5 分子對(duì)接結(jié)果

根據(jù)GO及KEGG富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)sAT化學(xué)成分治療IS靶標(biāo)多參與血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)。因此本研究將sAT中31種化學(xué)成分與核心靶標(biāo)中與血管新生相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行對(duì)接，即VEGFA、MMP9、MMP2、FGF2、EGFR，將其作為對(duì)接蛋白，由于KDR為VEGFA的主要受體，與血管新生過(guò)程息息相關(guān)，因此，將其納入對(duì)接蛋白，對(duì)接蛋白基本信息見(jiàn)表4。對(duì)接結(jié)果提示，31種化學(xué)成分都與多個(gè)靶標(biāo)有不同程度的有效結(jié)合。結(jié)合能小于－7.0 kcal·mol－1，同時(shí)作用于5個(gè)靶標(biāo)的有3個(gè)化學(xué)成分，分別為楤木皂苷D、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅰb；同時(shí)作用于4個(gè)靶標(biāo)的有12個(gè)化學(xué)成分。選擇與6個(gè)靶標(biāo)結(jié)合最好的5種化學(xué)成分深入分析，結(jié)果見(jiàn)圖1～6。

表4 AutoDock Vina計(jì)算中6個(gè)靶標(biāo)的參數(shù)設(shè)置及對(duì)應(yīng)結(jié)果 Tab 4 Parameters setting and corresponding results of 6 targets by AutoDock Vina calculation

3.5.1 去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與VEGFA相互作用 去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與VEGFA對(duì)接結(jié)果如圖1，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa羥基的氫與TRP105及LEU4形成2個(gè)氫鍵作用，母核與TYR104形成Pi-σ鍵，與LYS45、VAL58、LEU47和PRO59形成烷基及Pi-烷基鍵。

圖1 去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與VEGFA對(duì)接結(jié)果圖Fig 1 Docking diagram of deglucose-chikusetsu saponin Ⅳa with VEGFA

3.5.2 去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與FGF2相互作用 去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與FGF2對(duì)接結(jié)果如圖2，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa羥基的氫與GLY122形成氫鍵，與ARG33及ARG81氨基酸殘基形成2個(gè)氫鍵作用，此外，母核與ARG39形成烷基鍵，甲基與TYR124形成Pi-烷基鍵。

圖2 去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與FGF2對(duì)接結(jié)果圖Fig 2 Docking diagram of deglucose-chikusetsu Saponin Ⅳa with FGF2

3.5.3 竹節(jié)參皂苷Ⅰb與EGFR相互作用 竹節(jié)參皂苷Ⅰb與EGFR對(duì)接結(jié)果如圖3，竹節(jié)參皂苷Ib與ASP323、BMA3283氨基酸殘基形成2個(gè)氫鍵作用，此外，母核與ALA122及LEU178形成烷基鍵。

圖3 竹節(jié)參皂苷Ⅰb與EGFR對(duì)接結(jié)果圖Fig 3 Docking diagram of chikusetsu saponin Ⅰb with EGFR

3.5.4 蕷知子皂苷Ⅳ與MMP2相互作用 蕷知子皂苷Ⅳ與MMP2對(duì)接結(jié)果如圖4，蕷知子皂苷Ⅳ與GLY81、ASP80、ASP77、TYR74、LEU82、ALA84分別形成6個(gè)氫鍵作用，母核與TYR142、LEU83、HIS130形成烷基及Pi-烷基鍵。

圖4 蕷知子皂苷Ⅳ與MMP2對(duì)接結(jié)果圖Fig 4 Docking diagram of yuzhizioside Ⅳ with MMP2

3.5.5 太白楤木皂苷Ⅸ與MMP9相互作用 太白楤木皂苷Ⅸ與MMP9對(duì)接結(jié)果如圖5，太白楤木皂苷Ⅸ與ASP235、TYR248、TYR245、LEU188、ALA191、MET247、GLY186形成7個(gè)氫鍵作用，母核與HIS236、LEU187、HIS230形成烷基及Pi-烷基鍵。

圖5 太白楤木皂苷Ⅸ與MMP9對(duì)接結(jié)果圖Fig 5 Docking diagram of taibaienoside Ⅸ with MMP9

3.5.6 楤木皂苷D與KDR相互作用 楤木皂苷D與KDR對(duì)接結(jié)果如圖6，楤木皂苷D與GUL885形成1個(gè)氫鍵作用，母核與HIS1026、LEU889、ILE1044、VAL899、CYS1024、ILE888、CYS1045形成烷基及Pi-烷基鍵。

圖6 楤木皂苷D與KDR相互作用對(duì)接結(jié)果圖Fig 6 Docking diagram of araloside D with KDR

3.6 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

3.6.1 細(xì)胞活性 與正常組比較，模型組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01），提示OGD/R模型引起HUVECs活性下降。與模型組比較，溶劑組細(xì)胞活性無(wú)明顯變化，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa各濃度組細(xì)胞活性均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示其可提高HUVECs OGD/R損傷后的活性且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 各組細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）Fig 7 Survival rate of cells in each group（±s，n＝3）

3.6.2 細(xì)胞中VEGF水平測(cè)定結(jié)果 與正常組比較，模型組細(xì)胞VEGF水平顯著降低（P＜0.01），提示OGD/R模型引起HUVECs中VEGF水平下降。與模型組比較，溶劑組細(xì)胞VEGF水平無(wú)明顯變化，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa中、高濃度組細(xì)胞VEGF水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示其可提高HUVECs OGD/R損傷后的VEGF水平且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 各組細(xì)胞中VEGF水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）Fig 8 VEGF content of cells in each group（±s，n＝3）

3.6.3 細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常組比較，模型組細(xì)胞蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），提示OGD/R模型引起HUVECs中VEGF蛋白表達(dá)下降。與模型組比較，溶劑組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa中、高濃度組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示其可提高HUVECs OGD/R損傷后的VEGF蛋白表達(dá)且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 各組細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n＝3）Fig 9 VEGF protein expression of cells in each group（±s，n＝3）

4 討論

中藥所含化學(xué)成分復(fù)雜，其藥理作用是中藥所含多種藥效物質(zhì)通過(guò)多途經(jīng)、多環(huán)節(jié)和多靶標(biāo)所表現(xiàn)出來(lái)的綜合或整合作用[29]，作用機(jī)制復(fù)雜，中藥藥效物質(zhì)的研究是目前中醫(yī)藥研究面臨的最重要、最關(guān)鍵的問(wèn)題。中藥治療腦卒中歷史悠久，大量體內(nèi)外研究已證明多種中藥制劑或其單體成分可通過(guò)促進(jìn)血管新生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[30]。中藥多成分作用于多靶標(biāo)的藥用特點(diǎn)與疾病復(fù)雜的作用機(jī)制相對(duì)應(yīng)，但其主要藥效成分的研究仍不明確，為闡明其作用藥效物質(zhì)，本文采用網(wǎng)絡(luò)

藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)篩選，節(jié)約了大量人力、物力和財(cái)力，為新藥的研發(fā)提供了一定的參考。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，收集了31種sAT化學(xué)成分及其治療IS靶標(biāo)71個(gè)。GO和KEGG富集分析提示sAT化學(xué)成分治療IS主要與血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、鈣離子超載生物過(guò)程相關(guān)。血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)是治療IS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[31]，sAT化學(xué)成分通過(guò)作用于VEGFA、EGFR、FGF2等核心靶標(biāo)調(diào)控VEGF、PI3KAkt、HIF-1等信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、遷移、血管生成正向調(diào)控和細(xì)胞外基質(zhì)分解等生物過(guò)程。細(xì)胞凋亡貫穿IS發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，sAT化學(xué)成分通過(guò)作用于CASP3、BCL2L1等核心靶標(biāo)調(diào)控Apoptosis、FOXO、MAPK等信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡過(guò)程。研究表明，通過(guò)上調(diào)OGD VECs細(xì)胞和MCAO大鼠PI3K/AKT蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，減少ROS的生成，減少細(xì)胞凋亡，可發(fā)揮腦保護(hù)作用[32]。炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是IS發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因素，sAT化學(xué)成分可通過(guò)作用于TNF、PTGS2、IL1B等核心靶標(biāo)，調(diào)控TNF、toll樣受體、NOD樣受體等信號(hào)通路，進(jìn)而影響炎癥過(guò)程。研究表明，在腦缺血早期階段，促炎因子TNF-α的分泌或合成增加是導(dǎo)致腦梗死的主要原因[33]。鈣信號(hào)通過(guò)激活內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制在保護(hù)腦缺血-再灌注損傷中發(fā)揮作用，sAT化學(xué)成分通過(guò)作用于MAPK1、MAPK8、PLC等核心靶標(biāo)，調(diào)控鈣信號(hào)通路，進(jìn)而影響胞質(zhì)鈣離子正調(diào)控等生物過(guò)程。鈣信號(hào)通路系統(tǒng)可以和其他信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激后的適應(yīng)性，通過(guò)阻止胞外鈣離子過(guò)度內(nèi)流，避免細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載對(duì)缺氧神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)[34]。

根據(jù)GO及KEGG富集分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)sAT化學(xué)成分治療IS靶標(biāo)多參與血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)，分子對(duì)接結(jié)果顯示去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa、楤木皂苷D、竹節(jié)參皂苷Ib與血管新生靶標(biāo)結(jié)合較好，很有可能是其治療IS的藥效物質(zhì)。

VEGF是現(xiàn)公認(rèn)最重要的也是最有效的一種高度特異性促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，直接參與缺血缺氧組織或器官的血管生成[35]。VEGF家族有許多成員，其中VEGFA是VEGF家族中最重要的成員，KDR是VEGF特異性結(jié)合高親和力的受體，激活下游蛋白發(fā)揮生物功能，對(duì)于血管修復(fù)具有重要作用[36]。分子對(duì)接結(jié)果顯示去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa和楤木皂苷D與VEGFA/KDR強(qiáng)烈結(jié)合，很可能是太白楤木皂苷治療IS作用于VEGFA/KDR靶標(biāo)的藥效物質(zhì)。MMPs是一組依賴鈣離子和鋅離子的蛋白內(nèi)切酶，其中MMP2、MMP9與血管新生關(guān)系最為密切。分子對(duì)接結(jié)果顯示，楤木皂苷D、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa及竹節(jié)參皂苷Ib都能與MMP2及MMP9很好地結(jié)合。FGFs是由FGF基因家族編碼的結(jié)構(gòu)相關(guān)的一組蛋白質(zhì)多肽，F(xiàn)GF家族在促進(jìn)血管生長(zhǎng)、改善神經(jīng)功能缺損等方面發(fā)揮重要作用，F(xiàn)GF2是其家族中的一種，能間接促進(jìn)VEGF生成，對(duì)于腦卒中后神經(jīng)發(fā)生和血管生成至關(guān)重要。EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，EGF與其受體EGFR結(jié)合后，磷酸化激活下游信號(hào)分子ERK和Elk-1，從而促進(jìn)細(xì)胞生存，在細(xì)胞增殖及血管新生方面起重要作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa和FGF2結(jié)合最好，竹節(jié)參皂苷Ib與EGFR結(jié)合最好。

基于VEGFA與血管新生過(guò)程密切相關(guān)并且與去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)接效果最好，因此本研究選取去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa與對(duì)接靶標(biāo)VEGFA，驗(yàn)證去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa是否通過(guò)作用于VEGFA靶標(biāo)促進(jìn)血管新生，發(fā)揮腦保護(hù)作用。通過(guò)復(fù)制HUVECs OGD/R模型，觀察不同劑量去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)HUVECs活性及VEGF的釋放和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa能夠提高細(xì)胞活性，促進(jìn)VEGF的釋放和蛋白表達(dá)且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步闡明了sAT化學(xué)成分治療IS的可能作用機(jī)制，并利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)sAT化學(xué)成分促進(jìn)血管新生治療IS的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，共篩選出15種同時(shí)與多個(gè)血管新生相關(guān)靶標(biāo)結(jié)合的化學(xué)成分，其中最具潛力的為去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa、楤木皂苷D及竹節(jié)參皂苷Ib，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa促進(jìn)血管新生，發(fā)揮腦保護(hù)作用的可能機(jī)制為上調(diào)HUVECs VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)VEGF釋放，提高細(xì)胞活性，與分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果一致，提示網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)可用于中藥治療疾病的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究。