閆慧，孫國祥，孫萬陽，蘭麗麗，李想，蒲道俊，胡延雷，賈景明，陳振鴻（.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽 00；.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 00；3.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 03；.西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 00038；.國藥集團(tuán)工業(yè)有限公司，北京 030；.新疆富沃藥業(yè)有限公司，新疆 阿克蘇地區(qū) 899）

藥物一致性評價，狹義上要求仿制藥與原研藥符合相同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，廣義上要求兩者具有相同的活性成分和適應(yīng)證，藥物劑型規(guī)格和給藥途徑相同，符合相同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到生物等效，即藥學(xué)等效和藥效等效[1]。由于中藥（traditional Chinese medicine，TCM）沒有進(jìn)行過系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化過程，因此無法采用參比制劑來進(jìn)行一致性評價。與化藥相比，中藥來源復(fù)雜，藥效成分多樣，對某種疾病起效可能為幾種成分的協(xié)同作用，故僅檢測其中的一種或幾種成分不能達(dá)到整體評價中藥質(zhì)量的目的，這給中藥的質(zhì)量評價帶來很大的困難。因此，為了更加系統(tǒng)準(zhǔn)確地評價中藥的質(zhì)量，孫國祥教授建立了中藥定量指紋圖譜評價理論和技術(shù)，提出中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑控制模式和全質(zhì)量關(guān)控制模式。中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑控制模式是中藥一致性評價首選模式，尤其是雙標(biāo)校正后的標(biāo)準(zhǔn)制劑的對照指紋圖譜將是中藥一致性評價的必由之路。中藥系統(tǒng)指紋定量法從宏觀定性和宏觀定量角度出發(fā)，以定量指紋圖譜控制中藥中整體化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)而成為整體評價中藥質(zhì)量的新方法[2]。本文在中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑建立后，采用定量指紋圖譜技術(shù)模式即中藥指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量分析相結(jié)合的中藥質(zhì)量控制模式[3]。

但由于中藥成分復(fù)雜，某些對照品價格昂貴或難得，使得某些成分的定量控制比較困難，因此，王智民等[4]提出了一測多評法。一測多評法的出現(xiàn)不僅減少了中藥質(zhì)量評價的成本，也簡化了測定過程，提高了工作效率。一測多評法是通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，建立樣品中某一有效、價廉、易得的典型成分與樣品其余成分間的相對校正因子（relative correction factor，RCF）以計算樣品中其他成分的量[4]。但是一測多評法在技術(shù)上存在4個方面的不足：① 缺乏線性范圍考察和系統(tǒng)方法學(xué)驗證技術(shù)，導(dǎo)致誤差較大；② 無誤差分析理論和可靠度分析理論，導(dǎo)致分析方法可靠度無法驗證，也無法指導(dǎo)試驗技術(shù)人員如何避免誤差；③ 色譜體系無誤差校正方法，通常檢測色譜條件與當(dāng)初建立標(biāo)準(zhǔn)的色譜系統(tǒng)存在系統(tǒng)定量誤差，誤差傳遞導(dǎo)致最終結(jié)果誤差較大（大于5%）；④ 理論技術(shù)不夠扎實，數(shù)學(xué)上理論探討不夠深入。

本文在一測多評法的基礎(chǔ)上，提出一線多評法（multi-markers assay by monolinear method，MAML），即基于一測多評法原理并結(jié)合中藥定量指紋圖譜理論提出的新方法，彌補了一測多評法在技術(shù)上的缺陷和不足。既然中藥定量指紋圖譜承認(rèn)所確定的全部指紋峰都能整體定量，那么對于主要的幾個指標(biāo)成分的量值分布必然有確定的函數(shù)關(guān)系，因此必然能使用一測多評法。一測多評法最大缺陷是忽略了線性范圍，考察濃度范圍太窄，忽視了建立標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)和檢驗系統(tǒng)之間的量值校正問題即系統(tǒng)定量誤差沒進(jìn)行任何校正。一線多評法是在多指標(biāo)定量時采用與指紋圖譜檢測相同的色譜條件同時建立多個活性化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用一測化合物（一測物）和多評化合物（多評物）標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)計算校正因子、誤差、可靠度，從而實現(xiàn)用一測物標(biāo)準(zhǔn)曲線對多評物進(jìn)行定量的分析方法。當(dāng)方法建立后，以一線多評法對多評物進(jìn)行定量時的計算公式與一測多評法相同（一般以線性范圍的平均濃度進(jìn)行試驗），不同的是相對校正因子由多條標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)計算而來，具有誤差分析和校正理論及可靠度分析理論。因此一線多評法是在定量指紋圖譜基礎(chǔ)上利用多條標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的與定量指紋系統(tǒng)具有密切關(guān)聯(lián)度量值的相對校正因子法，由于有雙標(biāo)校正法而實現(xiàn)定量誤差可控或很小。中藥定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評能實現(xiàn)對中藥化學(xué)指紋物質(zhì)總量的等位等效控制。 孫國祥教授提出：① 中藥多指標(biāo)定量分析屬于中藥質(zhì)量的多點或者多點線質(zhì)量控制模式（兩點確定一直線，因此是線性控制范圍）；② 定量指紋圖譜控制屬于從中藥主組分化學(xué)成分出發(fā)形成的平面輪廓控制（用指紋圖譜定性控制是形象化外觀圓控制，用中藥指紋圖譜定量控制是對總量的幅度控制-大小不同圓）；③ 中藥溶出度控制屬于對中藥主組分指紋溶出的立體控制-球形（實際情況可能為凹凸不規(guī)則的球）。中藥質(zhì)量一致性評價必須是基于標(biāo)準(zhǔn)制劑的點線面立體化控制，見圖1。中藥質(zhì)量一致性評價的藥學(xué)質(zhì)量研究應(yīng)從這三個方面開展，才能控制好藥效物質(zhì)總量的等位，同時控制好體外溶出度一致性來實現(xiàn)對中藥固體制劑工藝過程的一致性控制——質(zhì)量與藥效實現(xiàn)等位等效。

圖1 中藥一致性評價點線面立體控制模型（Q-markers點線控制，指紋圖譜圓面控制和溶出度立體球控制）Fig 1 Dot-line-plane-stereoscopic control model for TCM consistency evaluation（dot-line control of Q-markers，circular plane control of fingerprints and stereoscopic ball control of dissolution）

1 定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評法模型的建立

1.1 一線多評法線性范圍

在定量指紋圖譜條件下的多指標(biāo)定量時，必須采用統(tǒng)一化色譜條件同時建立多條標(biāo)準(zhǔn)曲線，用其中一條標(biāo)準(zhǔn)曲線來對多指標(biāo)分別準(zhǔn)確定量的方法稱為一線多評法。一線多評法的最大特點是把標(biāo)準(zhǔn)曲線法最大程度地簡化，節(jié)省對照品使用。具體要求為：① RCF（fsi）必須滿足一定線性范圍，推薦10～20倍濃度范圍，最大不超過100倍；② 一測物線性范圍為Rs＝[Cs1，Cs2]，多評物線性范圍為Ri＝[Ci1，Ci2]，則被測物濃度應(yīng)在Ri＝[Ci1，Ci2]，通常線性范圍的均值濃度為最佳點Cavg＝（C1＋C2）/2；③ 用標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝bC＋a求RCF更合理（有線性范圍）。用線性方程求RCF特點：① 用最小二乘法計算濃度斜率bi，能準(zhǔn)確地揭示峰面積對濃度增長的靈敏度，且給出誤差項ai（標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距）；② 給出的線性范圍和相關(guān)系數(shù)能揭示濃度適用范圍和誤差大??；③ 用截距和截距斜率容易計算fsi誤差；④ 方法可靠度能預(yù)先準(zhǔn)確估算；⑤ 一線多評法方法學(xué)驗證后，仍然采用一點法或兩點法對多指標(biāo)成分定量，因此檢驗工作中沒必要每次都作標(biāo)準(zhǔn)曲線，避免浪費對照品和資源。

1.2 一線多評法應(yīng)用

一測物S標(biāo)準(zhǔn)曲線和多評物i標(biāo)準(zhǔn)曲線見公式（1）和（2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算一測物絕對校正因子fi見公式（3）和（4）。bas＝as/Cs，bai＝ai/Ci分別為一測物S截距斜率和多評物i截距斜率（即斜率絕對誤差）。可知測定絕對校正因子時，一測物Cs和多評物Ci對bas和bai影響很大，兩者濃度越大則截距斜率越小，即高濃度測定誤差很小。線性平均濃度C0＝0.5（C1＋C2）（即通常為測定樣品濃度，線性范圍中間濃度）為最佳。用斜率公式直接計算相對校正因子fsi見公式（5），把標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比稱為簡相對校正因子f'si，當(dāng)ba＝│a/C│≤1%b時可用斜率直接計算fsi，見公式（6）（誤差小于1.0%）。

一線多評法是建立在一測物S和多評物i的標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上，具有以下特點：① 線性范圍揭示一線多評法適用范圍；② 給出誤差范圍和可靠度；③ 基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的一線多評法科學(xué)性和準(zhǔn)確性顯著提高；④ 一線多評法只有在精密度和方法重復(fù)性均ba＝│a/C│≤1%b時，RSD≤2.0%才能保證方法的準(zhǔn)確度是可靠的。

1.3 一線多評法誤差

1.3.1 相對校正因子的相對誤差 按誤差傳遞規(guī)律得fsi相對誤差見公式（7），主要由一測物S和多評物i截距誤差之差所決定。用均值濃度計算截距斜率時，標(biāo)準(zhǔn)曲線自身誤差的大小決定了相對fsi誤差。計算一線多評的被測物濃度的相對誤差，見公式（8），稱量步驟的相對誤差小是十分重要的，得定量可靠度，見公式（9）。其中被測物相對峰面積誤差代入樣品中i組分精密度的RSDi（REi≈RSDi），一測物S的相對峰面積誤差代入對照品精密度試驗中的RSDs（REs≈RSDs），兩者有部分抵消作用（之差小于1.0%）：

① 若△fsi/fsi≤2.0%和△Csi/Cs≤2.0%，則定量誤差小于4.0%；定量可靠度R不低于95.5%；

② 若△fsi/fsi≤1.0%和△Csi/Cs≤1.0%，則定量誤差小于2.0%；定量可靠度R不低于97.7%；

③ 截距斜率誤差大小直接影響定量結(jié)果，一測物和多評物濃度越高則截距斜率越小，測定樣品準(zhǔn)確度越好。

1.3.2 一線多評法的相對誤差 如果標(biāo)準(zhǔn)曲線僅有截距誤差（制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度誤差小于1.0%），則測定多評物的可靠度，見公式（9），① 測定S和i峰面積均RSD≤2.0%（不含中間精密度），截距誤差小于1.0%，則方法可靠度大于96.7%；② 若五項相對誤差都小于1.0%，則方法誤差小于2.0%，可靠度大于97.7%，稱量誤差小顯得十分重要；③ 若五項相對誤差都小于2.0%，則方法誤差小于4.0%，可靠度大于95.5%；④ 當(dāng)斜率誤差較大時方法準(zhǔn)確度誤差約5.0%。當(dāng)只考慮截距誤差時，可靠度估算見表1。因為一線多評法的相對誤差只與測定混合對照品和多組分樣品時的儀器精密度試驗結(jié)果和稱量精密度有關(guān)。因此一線多評法的方法重復(fù)性試驗和準(zhǔn)確度試驗是評價該方法整體誤差的必要方法。根據(jù)各測量誤差進(jìn)行不確定度和可靠度大小進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)劃分，總計有9個等級，見表1。

表1 一線多評法的不確定度和可靠度劃分標(biāo)準(zhǔn) Tab 1 Unreliability and reliability of multi-markers assay by monolinear method

1.3.3 系統(tǒng)指紋定量法原理[5-8]系統(tǒng)指紋定量法（systematically quantified fingerprint method，SQFM）能從宏觀定性角度和宏觀定量角度對中藥進(jìn)行全方位立體量化控制，適合中藥質(zhì)量一致性評價。主要包括三個參數(shù)：宏定性相似度（Sm），宏定量相似度（Pm）和指紋均化變動系數(shù)（α），分別見公式（10～12）。其中α在分級控制時使用較少，只要充分利用好Sm和Pm就能實現(xiàn)對整體主組分指紋的定量控制，該方法還可用于紫外全指紋溶出度評價，同時還能以標(biāo)準(zhǔn)制劑（或參比制劑）為參照對不同批次中藥固體制劑溶出曲線的相似性進(jìn)行評價，因此SQFM和中藥溶出系統(tǒng)指紋定量法是中藥一致性評價的核心方法，它們的計算方法相同。

1.3.4 定量指紋圖譜雙標(biāo)校正法 色譜系統(tǒng)改變會帶來定量誤差，通過雙標(biāo)校正法進(jìn)行校正。把建立特征指紋圖譜（標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜）的系統(tǒng)稱為第一色譜系統(tǒng)（first chromatographic system，F(xiàn)CS），對發(fā)生誤差后的色譜系統(tǒng)稱為第二色譜系統(tǒng)（second chromatographic system，SCS），在 強 極 性 區(qū) 和弱極性區(qū)各選擇一個參照物峰作雙標(biāo)（一般為Q-markers），測定固定濃度雙標(biāo)混合溶液對應(yīng)峰面積來計算FCS和SCS的絕對定量校正因子fd1和fdi，見公式（13）和公式（14）[9]。SCS與FCS的絕對定量校正因子之比稱為雙標(biāo)相對定量校正因子fqi，見公式（15），把FCS定量性質(zhì)平移到新檢測系統(tǒng)可通過相對定量校正因子fqi與樣品稱樣質(zhì)量（mi）直接相乘實現(xiàn)校正，見公式（16），稱為雙標(biāo)校正法[9]。雙標(biāo)校正法能消除不同色譜系統(tǒng)在不同時間測定的指紋圖譜時所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，也能保證一線多評法誤差可控或很小。雙標(biāo)校正法是定量指紋圖譜執(zhí)行中藥質(zhì)量一致性評價的必要基礎(chǔ)和有效保證，是一線多評法應(yīng)用的前提條件。

2 方法

2.1 儀器與試藥

Agilent1100 型液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置、自動進(jìn)樣器），Agilent OpenLAB CDS Chemstation（Edition C.01.07）網(wǎng)絡(luò)工作站（Agilent科技有限公司）。Sarturius-BS 110S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；ES-E120D電子分析天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；超聲波清洗機（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；安捷倫706ds全自動溶出儀（配有850ds自動取樣器）。

磷酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司）；娃哈哈純凈水（沈陽娃哈哈啟力食品有限公司）；庚烷磺酸鈉（色譜純，山東省禹城市中美色譜產(chǎn)品廠）；嗎啡（MP，批號：171201-200822）、磷酸可待因（MMP，批號：171203-200504）、甘草苷（LQN，批號：111610-200604）、甘草酸銨（CHAA，批號：110731-201619）和苯甲酸鈉（SB，批號：100433-200301）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）。

復(fù)方甘草片（S1～S49為廠家A生產(chǎn)；S50～S61為廠家B生產(chǎn)；S62～S73為廠家C生產(chǎn)；S74～S85為廠家D生產(chǎn)；S86～S97為 廠 家E生 產(chǎn)；S98～S109為 廠 家F生 產(chǎn)；S110～S121為廠家G生產(chǎn)；S122～S133為廠家H生產(chǎn)；S134～S145為廠家I生產(chǎn)）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 雙標(biāo)溶液制備 分別取MP和CHAA對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含200 μg MP和800 μg CHAA的雙標(biāo)混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 混合對照品溶液制備 分別取MP、LQN、MMP、SB和CHAA對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含35 μg MP、60 μg LQN、16 μg MMP、160 μg SB和800 μg CHAA的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取復(fù)方甘草片10片，稱重，研細(xì)，精密稱取約4片量，置于50 mL量瓶中，精密加提取溶劑（80%甲醇溶液，含0.5%磷酸）50 mL，精密稱定，45℃超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）10 min，靜置至室溫，再精密稱定，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.2%磷 酸 水 溶 液（含0.005 mol·L－1庚烷磺酸鈉）為水相A，乙腈-甲醇（9∶1，V/V）溶液為有機相B，梯度洗脫（0～10 min，96%～79%A；10～20 min，79%～65%A；20～32 min，65%～47%A；32～45 min，47%～18%A；45～50 min，18%～15%A；50～55 min，15%～96%A）；檢測波長為220 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量為5 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

在此定量指紋圖譜系統(tǒng)的色譜條件下，以甘草酸（CHA）峰為參照物峰，并用壓縮因子τ的平方校正理論塔板數(shù)后要求應(yīng)不低于8500[10]。此外，連續(xù)進(jìn)樣測定6次考察儀器精密度；精密吸取S1供試品溶液，分別在溶液制備后的0、2、4、6、14、22 h進(jìn)樣測定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性；通過分析6個單獨同法制備的S1供試品溶液考察方法的重復(fù)性。評價時以CHA峰的保留時間和峰面積為參照，各共有指紋峰的相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，結(jié)果表明儀器進(jìn)樣精密度良好，供試品溶液在室溫放置22 h內(nèi)穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

3.2 復(fù)方甘草片指紋圖譜建立和評價

按“2.3”項下色譜條件測定9廠家共145批復(fù)方甘草片，記錄色譜圖。將積分后*.cdf文件導(dǎo)入【中藥主組分一致性數(shù)字化評價系統(tǒng)2.0】軟件（帶審計追蹤功能），以CHA峰的保留時間和峰面積為參照，確定28個共有指紋峰，按平均值法生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（RFP），見圖2，其中10號峰為MP峰，14號峰為LQN峰，15號峰為MMP峰，16號峰為SB峰，27號峰為CHA峰。以此RFP為評價標(biāo)準(zhǔn)對145批復(fù)方甘草片進(jìn)行評價，樣品指紋圖譜與RFP的Sm不得低于0.90，Pm應(yīng)在80%～120%。根據(jù)所得評價結(jié)果，以Sm和Pm為參數(shù)進(jìn)行聚類分析，采用SPSS軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果S75、S81～S85、S107～S109為第Ⅰ類，其余為第Ⅱ類。雖然Ⅰ類Pm數(shù)值偏大，但全部在規(guī)定范圍內(nèi)，決定不剔除任何批次樣品。9廠家樣品定量指紋圖譜評價結(jié)果見表2（以每個廠家所有批次結(jié)果的均值體現(xiàn)），表明9廠家產(chǎn)品質(zhì)量均合格。其中廠家A生產(chǎn)的批號為20171213、廠家B生產(chǎn)的批號為PDE0712、廠家E生產(chǎn)的批號為3180502、廠家G生產(chǎn)的批號為20180620以及廠家H生產(chǎn)的批號為18053001和18060501的復(fù)方甘草片的Sm≥0.95，Pm≈100%，可初步選作復(fù)方甘草片的標(biāo)準(zhǔn)制劑[11]。試驗中每隔一段時間進(jìn)樣測定雙標(biāo)溶液，記錄色譜圖，計算相對定量校正因子。結(jié)果表明在復(fù)方甘草片特征指紋圖譜研究期間（約45 d）以及樣品測定期間，fqi始終在0.97～1.03，系統(tǒng)定量性質(zhì)無顯著變化，不需對色譜系統(tǒng)進(jìn)行雙標(biāo)校正。

圖2 復(fù)方甘草片對照指紋圖譜（RFP）Fig 2 RFP of compound licorice tablet

表2 系統(tǒng)指紋定量法評價復(fù)方甘草片質(zhì)量一致性結(jié)果 Tab 2 Quality consistency of evaluated by the systematically quantitative fingerprints

從表2的結(jié)果可看出，所有廠家樣品的平均Sm均大于0.96，說明不同廠家生產(chǎn)的樣品之間定性相似度均良好，但只以定性相似度進(jìn)行評價，不同批次間的差異不顯著，不能有效地將不同批次的樣品質(zhì)量區(qū)分開來，只能表明不同廠家樣品之間的化學(xué)指紋數(shù)量和分布比例十分相似。因此在評價過程中引入Pm是十分必要的，根據(jù)Pm結(jié)果可進(jìn)一步區(qū)分不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方甘草片的質(zhì)量優(yōu)劣以及同一廠家樣品的批間相似性大小。從結(jié)果中可看出廠家A生產(chǎn)的復(fù)方甘草片平均Pm值最小，廠家D生產(chǎn)的復(fù)方甘草片平均Pm值最大，兩者相差16.4%，說明不同廠家樣品的化學(xué)指紋含量存在顯著差異。由此可見，中藥質(zhì)量評價時僅僅采取指紋圖譜定性參數(shù)評價不能達(dá)到全面控制中藥質(zhì)量的目的，定性參數(shù)結(jié)合指紋圖譜的定量相似度參數(shù)才能更準(zhǔn)確地評價中藥質(zhì)量。

3.3 含量測定

本文采用兩種方法測定復(fù)方甘草片中5種化合物含量：

① 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：精密稱定MP、LQN、MMP、SB和CHAA適量，用甲醇稀釋，制成6個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。每份溶液在上述色譜條件下各平行測定兩次，以峰面積均值（Aavg）對各對照品濃度（C，mg·mL－1）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3。5種化合物在各線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系均很好。利用各標(biāo)準(zhǔn)曲線以外標(biāo)法計算145批樣品中5種化合物含量，其中CHA含量應(yīng)在CHAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得值基礎(chǔ)上乘以0.9797[12]。

表3 5種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限和檢測限 Tab 3 Linear regression equation，correlation coefficient，linearity，LOQ and LOD of the five Q-markers

② 一線多評法：利用標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)公式分別計算一測物和多評物的bas/bai與fs/fi，進(jìn)而計算出各標(biāo)準(zhǔn)曲線的fsi，見表4。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算SB含量，再以SB含量和fsi計算其他4組分含量。另外，各組分的定量可靠度均不低于96.5%，見表4，表明方法可靠性滿足測定要求。以上兩種含量計算方法所得結(jié)果見表5（以每個廠家各含量結(jié)果均值體現(xiàn)）。另外，《中國藥典》2020年版要求每片復(fù)方甘草片中MP含量在0.36～0.44 mg，CHA含量不少于7.3 mg[12]，根據(jù)表5結(jié)果可知，除廠家A和廠家G的MP平均含量不合格外，其余廠家MP平均含量均符合藥典規(guī)定，此外，所有廠家CHA平均含量均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表4 復(fù)方甘草片一線多評法的各項參數(shù)值 Tab 4 Parameter of compound licorice tablet by multi-markers assay by monolinear method

表5 5種化合物含量測定結(jié)果 Tab 5 Content of the five Q-markers

將標(biāo)準(zhǔn)曲線法與一線多評法計算所得的每個廠家每種組分的平均含量結(jié)果進(jìn)行比較，計算相對誤差，見表6，兩種計算方法所得相對誤差最大值為0.46%，表明一線多評法能準(zhǔn)確測定復(fù)方甘草片中5種化合物含量。相較于標(biāo)準(zhǔn)曲線法，一線多評法可節(jié)省對照品與分析時間，為中藥及其復(fù)方制劑的含量測定提供了一種新的、簡便的思路。

表6 一線多評法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對誤差 Tab 6 Relative errors between standard curve method and multimarkers assay by monolinear method

4 討論

本文以復(fù)方甘草片為研究對象，通過高效液相色譜法測定145批樣品指紋圖譜，并建立復(fù)方甘草片標(biāo)準(zhǔn)制劑的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以系統(tǒng)指紋定量法進(jìn)行評價。本文提出中藥一致性評價應(yīng)以定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評法，實現(xiàn)復(fù)方甘草片主組分為中藥指紋組分的復(fù)方中藥制劑的整體質(zhì)量的量化控制。本文提出一線多評法理論、誤差估算方法和可靠度評價方法，該方法主要采用統(tǒng)一化色譜條件，建立雙標(biāo)校正法，消除測定系統(tǒng)變動帶來的系統(tǒng)定量誤差。通過比較一線多評法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法的計算結(jié)果，可知一線多評法所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡便，節(jié)省對照品，可降低檢測成本和減少分析時間，為中藥一致性評價既提供了定量指紋圖譜控制方法，也提供了一線多評法的多指標(biāo)定量方法，達(dá)到了在整體上控制好化學(xué)指紋物質(zhì)一致性的目的。因此，中藥定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評法構(gòu)成了中藥一致性評價的首要關(guān)鍵技術(shù)。本課題組在復(fù)方甘草片質(zhì)量一致性評價中充分使用標(biāo)準(zhǔn)制劑控制模型，用價廉易得的苯甲酸鈉對照品作為一測物來同時定量復(fù)方甘草片中其他4種藥效物質(zhì)，收到理想效果。