張改玲 賈亞瓊 張弦

[1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院普通血液及免疫治療科，廊坊 101601； 2.迪飛醫(yī)學(xué)科技(南京)有限公司，南京 210032]

急性髓系白血病(AML)是血液科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，治療手段有化療、靶向治療及免疫治療等?；熀罅Ｈ逼?，特別是嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏期[1]有相當(dāng)比例患者出現(xiàn)感染[2]。中國(guó)血液病患者中性粒細(xì)胞缺乏期間最常見(jiàn)的病原菌為革蘭陰性菌(44.54%)，其次為革蘭陽(yáng)性菌(37.99%)，真菌感染發(fā)生率相對(duì)較低(17.47%)[3]。毛霉病是一種由毛霉目真菌引起的、威脅生命的、罕見(jiàn)的機(jī)會(huì)性真菌感染，易引起組織壞死及血管血栓形成，易侵犯部位包括鼻、眼眶、肺、胃腸道、皮膚等[4]，但肌肉被毛霉菌感染的案例較為罕見(jiàn)。本文報(bào)道1例AML患者化療后感染毛霉，通過(guò)宏基因組測(cè)序(mNGS)得到及時(shí)診斷感染原，采用泊沙康唑及多烯類準(zhǔn)確治療后炎癥緩解的案例。

1 臨床資料

患者，男，47歲，出生、成長(zhǎng)于新疆，因考慮急性髓系白血病于2019年3月11日入我院?；颊呷朐簷z查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)1.11×109/L，血紅蛋白79.60 g/L，血小板27.60×109/L。胸部CT提示冠狀動(dòng)脈硬化，雙側(cè)胸膜略增厚。心臟超聲提示二、三尖瓣輕度反流，左心室舒張功能減低，左心室射血分?jǐn)?shù)為70%，左心室縮短分?jǐn)?shù)為40%。骨髓增生活躍，原始粒細(xì)胞占36%，外周血原始細(xì)胞占1%。骨髓流式結(jié)果顯示22.89%細(xì)胞為惡性髓系幼稚細(xì)胞。白血病融合基因篩查結(jié)果顯示MLL-PTD基因突變陽(yáng)性。骨髓染色體檢查結(jié)果為46,XY,der(6) t(6;18) inv(18) (q11.2q23) t(6;18)(p23;q23)。血液腫瘤突變結(jié)果提示U2AF1 S34F突變陽(yáng)性?；颊呷朐翰轶w：貧血貌，余無(wú)陽(yáng)性體征。既往有血糖偏高、高血壓病史。

臨床表現(xiàn) 患者2019年3月13日至4月13日進(jìn)行化療，期間予其行PICC置管后出現(xiàn)感染性發(fā)熱，體溫持續(xù)波動(dòng)于37 ℃～39.2 ℃，伴右側(cè)胸部疼痛，右手腕部腫脹疼痛，外周血1,3-β-D葡聚糖檢測(cè)/半乳糖甘露醇聚糖抗原檢測(cè)(G/GM)、外周血人類皰疹病毒(HHV1-HHV8)篩查以及血細(xì)菌、真菌培養(yǎng)試驗(yàn)均陰性，外周血C反應(yīng)蛋白(CRP)持續(xù)升高，降鈣素原(PCT)由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。4月20日右肺聽(tīng)診可聞及濕啰音，右肺下測(cè)呼吸音低，肺部CT顯示出現(xiàn)感染性病變(見(jiàn)圖1A、B)。按照急性白血病化療后粒缺期抗感染指南，先后給予頭孢吡肟、萬(wàn)古霉素、威凡、頭孢米諾、斯沃、達(dá)托霉素、泰能、替加環(huán)素、異煙肼、利福平等多種抗生素治療，效果欠佳，持續(xù)高熱。12 d內(nèi)右手臂紅腫進(jìn)行性加重，右手食指及大拇指出現(xiàn)麻木狀況，后期右前臂極度腫脹，質(zhì)硬，出現(xiàn)整個(gè)前臂缺血性紫黑現(xiàn)象，急診行右前臂切開負(fù)壓封閉引流術(shù)(VSD，見(jiàn)圖2A)。對(duì)患者右前臂開刀發(fā)現(xiàn)，肌肉組織已壞死，呈彌漫性暗紅色。

圖1 肺部CT檢測(cè). A.感染前肺部(4月13日);B.肺部出現(xiàn)感染(4月22日); C、D.肺部感染性病變加重(5月13日)； E、F.肺部感染區(qū)域縮小，前胸壁軟組織病變(5月22日)； G、H. 感染得到控制，右肺出現(xiàn)氣胸，胸腔積液和皮下積氣(6月13日)； I、J. 肺部好轉(zhuǎn)(9月21日)Fig.1 Pulmonary CT scan. A. The lungs before infection (4.13)； B. Infected lungs (4.22); C、D. Diseased lungs; E、F. Pulmonary infection area shrinked and soft tissue biof anterior chest wall appeared lesions (5.22)； G、H. Pulmonary infection control was achieved and pneumothorax appeared (6.13)； I、J. Lung condition improved markedly (9.21)

圖2 患者右上肢感染狀況. A.感染嚴(yán)重(4.26)；B.感染得到控制(5.22)；C.傷口基本愈合，感染消失(8.3)；D.傷口愈合(9.21)Fig.2 Infected right upper limb. A. Aggravated infection (4.26)； B. Infection control was achieved (5.22)； C. The wound began to heal and infection disappeared (8.3)； D. Wound healing (9.21)

mNGS檢測(cè) 采集患者外周血，肌肉組織及痰液，交由迪飛醫(yī)學(xué)科技(南京)有限公司進(jìn)行樣本測(cè)序和生物信息學(xué)分析。利用核酸提取試劑盒從樣本中提取DNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建后使用Illumina Next-seq儀器進(jìn)行單端測(cè)序。測(cè)序完成后對(duì)人類宿主序列進(jìn)行去除，獲得unmapped序列。將unmapped序列與微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，均檢出微小根毛霉(見(jiàn)表1)。

表1 mNGS檢測(cè)結(jié)果Tab.1 A mNGS results

分子生物學(xué)鑒定 對(duì)mNGS檢測(cè)提取的DNA設(shè)計(jì)引物并PCR擴(kuò)增約280 bp，外周血和肌肉組織為陽(yáng)性(見(jiàn)圖3)，PCR結(jié)果送去南京擎科生物測(cè)序,測(cè)序結(jié)果Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì)鑒定，比對(duì)到微小根毛霉(sequence ID: FWWN02000395.1，見(jiàn)圖4)，綜合考慮該患者可能存在毛霉菌感染。

圖3 PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoretogram

圖4 Genbank序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Sequence alignment results of Genbank

組織活檢 使用真菌熒光染色液試劑盒，以酶聯(lián)法用于標(biāo)記并吸附在真菌上的抗原結(jié)合位點(diǎn)形成強(qiáng)熒光復(fù)合物，置于熒光顯微鏡物鏡下，肉眼通過(guò)目鏡進(jìn)行直接鏡檢。右上臂肌肉活檢結(jié)果亦顯示有真菌感染菌絲結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖5A)。

組織微生物培養(yǎng) 進(jìn)行肌肉組織培養(yǎng)后將組織剪碎，加生理鹽水研磨接種血平板，經(jīng)乳酚棉藍(lán)染色后在顯微鏡下觀察真菌形態(tài)特征，肌肉組織培養(yǎng)出了根霉屬菌(見(jiàn)圖5B～D)。

圖5 組織病理結(jié)果. A. HE染色(×10); B. HE染色(×20); C. PAS染色(×40); D. 熒光法染色(×40)Fig.5 Pathological microscopy of the muscle tissues. A. Hematoxylin and Eosin staining; B. Hematoxylin and Eosin staining; C. PAS staining; D. Fluorescence staining

診斷與治療 確定病原后調(diào)整用藥，4月28日起，先后予以患者泊沙康唑(20 mL/d)聯(lián)合兩性霉素B(25 ～50 mg/d)或泊沙康唑(20 mL/d)聯(lián)合安必素(150～250 mg/d)進(jìn)行治療，同時(shí)給普通兩性霉素B進(jìn)行霧化吸入及傷口沖洗和房間消毒?；颊唧w溫波動(dòng)及治療方案見(jiàn)圖6。1周后患者體溫恢復(fù)正常，肺部影像(見(jiàn)圖1C、D)顯示：①右肺上、中葉內(nèi)病變，考慮為感染性病變，真菌感染可能。②右肺下葉內(nèi)側(cè)基底段胸膜下區(qū)病變性質(zhì)待定。③右側(cè)胸膜略增厚病伴有胸腔積液。④提示肝脾實(shí)質(zhì)內(nèi)多發(fā)結(jié)節(jié)狀低密度影，考慮為真菌感染。5月13日調(diào)整泊沙康唑(30 mL/d)聯(lián)合安必素(250 mg/d)的用藥劑量。5月22日肺部影像(見(jiàn)圖1E、F)顯示右肺及前胸壁軟組織病變，局部胸壁下級(jí)胸腔內(nèi)新見(jiàn)氣體。肌肉組織再次培養(yǎng)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，患者病情好轉(zhuǎn)(見(jiàn)圖2B)。因家庭經(jīng)濟(jì)困難，患者要求出院治療?；颊?月23日出院后一直維持口服泊沙康唑，體溫正常，帶瘤生存。隨訪顯示右前臂刀口逐步趨于愈合(見(jiàn)圖2C、D)。因患者家中不慎摔倒，出現(xiàn)右側(cè)肋骨骨折伴氣胸(見(jiàn)圖1G、 H)，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院處理氣胸后，患者持續(xù)服用泊沙康唑，后復(fù)查肺部CT,患者肺部感染癥狀好轉(zhuǎn)(見(jiàn)圖1I、J)。

圖6 患者治療過(guò)程中體溫監(jiān)測(cè)及用藥情況Fig.6 Body temperature monitoring and medication during treatment

2 討 論

毛霉菌病又稱接合菌病，是一種由毛霉目引起且威脅生命罕見(jiàn)的機(jī)會(huì)性真菌感染。毛霉菌病的發(fā)病率逐年增加，且診斷困難，病程多數(shù)呈急性進(jìn)展，死亡率高[5]。澳大利亞一項(xiàng)多中心、回顧性研究統(tǒng)計(jì)了2004—2012年74位毛霉菌病患者基礎(chǔ)疾病情況及分布，結(jié)果顯示毛霉菌病涉及眾多科室，主要為血液科[6]。Tedder等[7]綜合報(bào)道的255例肺毛霉菌病患者，其中惡性血液病占比達(dá)到37%，其次為糖尿病(32%)，其他易發(fā)因素有腎功能衰竭、器官移植、近期手術(shù)、實(shí)體腫瘤等。毛霉病的預(yù)后與基礎(chǔ)疾病狀態(tài)及治療時(shí)效有關(guān)[7]。大部分患者累及皮膚及呼吸道等接觸外界的部位，而深部肌肉部位的感染，特別是沒(méi)有外傷將毛霉菌帶入體內(nèi)的情況下，鮮有報(bào)道。

本文是1例AML化療后并發(fā)肌肉毛霉感染的罕見(jiàn)案例，患者化療后粒缺期持續(xù)發(fā)熱、右上側(cè)胸痛、右臂腫脹，先后給予多種抗生素治療，效果欠佳，持續(xù)高熱。毛霉病不易早期確診，特別是早期表現(xiàn)的一些臨床癥狀，極易誤診為其他病原體感染[8]。目前臨床診斷毛霉病的檢驗(yàn)手段存在不足，主要表現(xiàn)在無(wú)可靠血清學(xué)手段，PCR假陽(yáng)率高，病原體培養(yǎng)陽(yáng)性率低，G/GM試驗(yàn)也常為陰性等方面，為臨床治療造成了極大的不便[9]。

本案例使用最新檢測(cè)技術(shù)mNGS，快速準(zhǔn)確的輔助臨床檢測(cè)到患者外周血，肌肉組織及痰液樣本中均存在毛霉，臨床使用多烯類和三唑類抗真菌藥物使患者的感染得到控制。值得提出的是，mNGS檢測(cè)結(jié)果與臨床培養(yǎng)結(jié)果有一些出入，臨床組織培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為根霉屬菌，而mNGS檢測(cè)結(jié)果提示感染病原體是根毛霉屬中的微小根毛霉種。后續(xù)為驗(yàn)證mNGS檢測(cè)結(jié)果的可信度，將患者3個(gè)樣本中mNGS檢出的所有序列分別和NCBI中根霉屬和根毛霉屬的參考基因組進(jìn)行比對(duì)校準(zhǔn)，結(jié)果顯示檢測(cè)到的序列均特異性比對(duì)到根毛霉屬中的微小根毛霉，但未比對(duì)到根霉屬。分析可能的原因如下：一方面，毛霉菌普遍存在于腐敗的植物和土壤中，正常情況下存在于人的鼻咽部，當(dāng)機(jī)體免疫低下時(shí)，可通過(guò)吸入孢子等途徑進(jìn)入機(jī)體造成疾病[10]，對(duì)于這種環(huán)境中常見(jiàn)的病原體，組織培養(yǎng)可能因污染出現(xiàn)了假陽(yáng)的情況；另一方面，根霉屬和根毛霉屬同屬于毛霉科，表型相似度較高，培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生了誤判。同時(shí)，進(jìn)一步驗(yàn)證mNGS檢測(cè)結(jié)果的可信度，對(duì)mNGS檢測(cè)提取的DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證外周血和肌肉組織為微小根毛霉，但可能由于痰液中微小根毛霉?jié)舛群艿?，所以痰液PCR擴(kuò)增陰性。

從患者案例可以看出，mNGS技術(shù)可檢測(cè)樣本中的所有病原微生物，檢測(cè)沒(méi)有偏好性，不依賴經(jīng)驗(yàn)，可以很大程度的減少假陰和誤判的情況。檢測(cè)結(jié)果顯示3個(gè)感染樣本中都檢出有微小根毛霉，且外周血和肌肉組織序列數(shù)較高，可以很大程度輔助臨床排除是環(huán)境污染造成的陽(yáng)性檢出率；通過(guò)檢出序列的特異比對(duì)，檢出序列數(shù)因組覆蓋度的高指標(biāo)降低了由同源性造成的比對(duì)不準(zhǔn)的可能性。綜上所述，組裝級(jí)別高，精準(zhǔn)度高的高質(zhì)量病原微生物基因組的發(fā)布，對(duì)于未來(lái)mNGS病原精準(zhǔn)診斷起著決定性的作用，mNGS在不依賴臨床判斷的基礎(chǔ)上可以大范圍快速的診斷病原微生物，非常適用于一些罕見(jiàn)，傳統(tǒng)診斷困難和病程急的感染性疾病的診斷。因此傳統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)手段結(jié)合mNGS病原檢測(cè)對(duì)于未來(lái)精準(zhǔn)治療意義重大。