李穎 黃晶晶 劉文靜 王培昌 徐英春

(1. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053； 2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；3. 侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730)

近年來，曲霉、鐮刀菌、接合菌等絲狀真菌的臨床感染率有升高趨勢，在某些特定人群中其感染率甚至超過酵母菌[1-3]。絲狀真菌種類繁多，不同種屬菌株對常用抗真菌藥物的反應多有差別，如土曲霉和尖端賽多孢霉對兩性霉素B天然耐藥；鐮刀菌對棘白菌素類抗真菌藥物不敏感，對多數(shù)新型唑類藥物僅中度敏感；接合菌除對棘白菌素天然耐藥外，另有部分菌種對唑類藥物耐藥[4-6]。所以，對絲狀真菌進行準確種屬鑒定可以有針對性地指導臨床選用抗真菌藥物，減少無效或錯誤用藥。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作為微生物快速鑒定分析技術已被成功應用于臨床細菌及酵母菌菌種鑒定；但在絲狀真菌鑒定方面，其應用程度及鑒定能力略遜。除絲狀真菌本身細胞壁厚這一客觀因素外，現(xiàn)有的商業(yè)絲狀真菌質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫涵蓋菌種數(shù)不足也是重要原因之一[7-8]。相應地，國際上多個研究機構分別致力于建立本地絲狀真菌質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫，其中規(guī)模較大的有Lau AF等研究人員建立的美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫和法國與比利時學者聯(lián)合建立的大型真菌質(zhì)譜鑒定(mass spectrometry identification，MSI)平臺，通過自建數(shù)據(jù)庫可以有效提升MALDI-TOF MS對絲狀真菌的鑒定效率[9-12]。2019年由國內(nèi)多位專家共同編撰的《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定數(shù)據(jù)庫專家共識》對自建數(shù)據(jù)庫的操作流程及注意事項等方面進行了明確規(guī)范與建議[13]。本研究參照該共識建立適當規(guī)模的MALDI-TOF MS絲狀真菌鑒定本地數(shù)據(jù)庫，擬提高實驗室對絲狀真菌分離株的鑒定能力。

1 材料與方法

1.1 菌株

建庫菌株 整理北京協(xié)和醫(yī)院2014年1月—2016年12月分離自臨床患者送檢標本的絲狀真菌，選取具有代表性的菌種，每一種屬菌株數(shù)≥1株。建庫菌株均采用分子測序技術準確鑒定到種水平，其中曲霉采用鈣調(diào)蛋白(CaM)基因測序，鐮刀菌采用轉(zhuǎn)錄延長因子1α(EF-1α)基因測序，接合菌等余下菌種采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測序[14-15]。

評估菌株 收集北京協(xié)和醫(yī)院2016年1月—2017年6月分離自臨床患者送檢標本的絲狀真菌。評估菌株在復蘇傳代后均經(jīng)進行形態(tài)學鑒定初步確定種屬信息。

1.2 試劑材料

Bruker Biotyper AutoflexTMMALDI-TOF MS系統(tǒng)、α-氰基-4-對羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)基質(zhì)液、BTS標準品均購自德國Bruker Doltanics公司。甲酸和三氟乙酸溶液均購自法國Sigma-Aldrich公司。乙腈溶液購自比利時ACROS Organics公司。真菌用沙堡弱葡萄糖瓊脂(Sabouraud dextrose agar，SDA)培養(yǎng)基購自英國OXOID公司，絲狀真菌基因組DNA 提取采用德國QIAGEN DNA mini試劑盒。

1.3 Bruker Biotyper自建數(shù)據(jù)庫

自建數(shù)據(jù)庫流程按照Bruker Biotyper用戶手冊進行：①擬建庫菌株的純培養(yǎng)；將基因測序鑒定明確的絲狀真菌菌種以3點式接種SDA平皿置于28℃溫箱進行傳代培養(yǎng)。②質(zhì)譜分析前處理；參照《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定數(shù)據(jù)庫專家共識》建議，分別取培養(yǎng)第2～3天的較幼稚菌落和培養(yǎng)至第5～7天較成熟菌落進行建庫操作，具體流程為采用標準甲酸-乙腈提取法對適量菌絲進行前處理，包括75%酒精滅活菌體，甲酸溶液裂解菌體細胞壁，乙腈溶液促進核糖體蛋白釋出，吸取1 μL上清點樣于Bruker MSP 384靶板，干燥后再滴加1 μL HCCA基質(zhì)液，每一建庫菌株平行點樣8次，共8個待分析靶點。③自建數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜圖獲??；按照用戶手冊對Bruker MS儀器進行日常校準。每個靶點采集3張高質(zhì)量質(zhì)譜圖，每一建庫菌株共采集24張質(zhì)譜圖。采用Bruker Flex Analysis軟件對24張質(zhì)譜圖進行篩選，除去質(zhì)量較差的譜圖，同時保證余下高質(zhì)量質(zhì)譜圖>20張；若無法滿足此條件應重復進行建庫質(zhì)譜圖獲取。④建立數(shù)據(jù)庫；將>20張高質(zhì)量質(zhì)譜圖在Bruker Biotyper軟件中整合成一張代表性參考質(zhì)譜圖，對該參考質(zhì)譜圖進行菌種信息命名并保存。

1.4 Bruker Biotyper自建數(shù)據(jù)庫鑒定能力的評估

采用臨床絲狀真菌分離株對該MALDI-TOF MS自建庫的鑒定能力進行評估，操作流程同標準提取法MALDI-TOF MS鑒定。數(shù)據(jù)庫分別選用Bruker商業(yè)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(Bruker Filamentous fungi Library 1.0)、本地自建數(shù)據(jù)庫(In-house database)和二者聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(Combined database)，根據(jù)鑒定率差異來評估最優(yōu)數(shù)據(jù)庫模式。MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果判讀標準為：鑒定分值≥2.000，種水平鑒定正確；鑒定分值1.700～1.999，僅屬水平鑒定正確；鑒定分值<1.700則為無法鑒定。對于曲霉評估菌株，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致即認為鑒定準確，對于鑒定結(jié)果不一致(包括一種方法鑒定至屬水平而另一種方法鑒定至種水平或兩種方法均鑒定至屬水平)的菌株則進一步采用CaM基因測序鑒定；對于非曲霉絲狀真菌，無論MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致與否均采用ITS或EF-1α基因測序明確菌株種屬信息。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件；本研究數(shù)據(jù)類型為多項有序分類變量，多樣本比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩樣本間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義[16]。

2 結(jié) 果

2.1 MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫概況

建庫菌株41株，其中曲霉22株，12種；鐮刀菌3株，2種；接合菌7株，5種；其他菌株9株分屬于6個不同種(見表1)。對每一建庫菌株分別取SDA培養(yǎng)2～3 d(幼稚)和5～7 d(成熟)菌落進行自建庫處理，共得到參考質(zhì)譜圖82張。

表1 Bruker MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫菌株列表Tab.1 Lists of strains with mass spectra profiles in the MALDI-TOF MS in-house database

2.2 MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫的鑒定能力評估

評估用絲狀真菌臨床分離株236株，其中曲霉200株，非曲霉絲狀真菌36株。按照Bruker推薦的鑒定結(jié)果判定標準，Bruker商業(yè)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(簡稱Bruker Library)僅可將29.2% (69/236) 評估菌株鑒定至種水平，47.9% (113/236) 菌株鑒定至屬水平，22.9% (54/236) 菌株因鑒定分值<1.700而無法鑒定。采用本研究自建數(shù)據(jù)庫，67.5% (159/236) 受試菌株因其鑒定分值≥2.000可實現(xiàn)種水平鑒定，另有19.9% (47/236) 菌株可實現(xiàn)屬水平鑒定。將Bruker Library與本研究自建數(shù)據(jù)庫聯(lián)合后，76.3% (180/236) 受試菌株可實現(xiàn)種水平鑒定，19.1% (45/236) 菌株可實現(xiàn)屬水平鑒定，僅4.6% (11/236) 菌株無法鑒定(見表2)。經(jīng)統(tǒng)計學分析，3種數(shù)據(jù)庫模式間對評估菌株的鑒定能力存在顯著性差異(χ2=116.447，P<0.001)；除Bruker Library鑒定能力顯著低于自建數(shù)據(jù)庫和聯(lián)合數(shù)據(jù)庫外，聯(lián)合數(shù)據(jù)庫的鑒定能力要優(yōu)于單獨應用自建數(shù)據(jù)庫(Z=-2.478，P=0.013)。本研究中，Bruker Library在受試菌株種水平鑒定結(jié)果存在1個錯誤鑒定情況(1株塔賓曲霉被錯誤鑒定為黑曲霉，鑒定分值2.041)；應用自建數(shù)據(jù)庫，在提高了受試菌株種水平鑒定率的同時并未導致種水平錯誤鑒定情況發(fā)生；將Bruker Library和自建數(shù)據(jù)庫聯(lián)合應用后，種水平鑒定率為三者間最高且仍保持良好的種水平鑒定準確率。

表2 MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫對絲狀真菌臨床分離株鑒定能力的評估Tab.2 Evaluation of the MALDI-TOF MS in-house database in identification of clinical filamentous fungi isolates n(%)

2.3 絲狀真菌形態(tài)學鑒定與MALDI-TOF MS鑒定能力比較

以聯(lián)合數(shù)據(jù)庫為Bruker MALDI-TOF MS鑒定用數(shù)據(jù)庫，將評估菌株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果進行比較，形態(tài)學方法將81.4% (192/236) 菌株鑒定到種水平，其中有4.2% (8/192) 菌株在種水平鑒定錯誤，故形態(tài)學方法對受試絲狀真菌的種水平鑒定準確率為95.8% (184/192)。MALDI-TOF MS聯(lián)合數(shù)據(jù)庫對受試絲狀真菌的種水平鑒定率為76.3% (180/236)，略低于形態(tài)學方法，但不存在種水平鑒定錯誤的情況，即種水平鑒定準確率為100%。進一步分析，對于臨床常見曲霉分離株，MALDI-TOF MS較形態(tài)學方法并未展現(xiàn)出鑒定優(yōu)勢[80.7% (175/181)vs.96.7% (146/181)]；對于少見曲霉種和非曲霉絲狀真菌，MALDI-TOF MS的鑒定能力顯著優(yōu)于形態(tài)學方法，鑒定準確率更高[16.4% (9/55)vs.61.8% (34/55)，Z=-3.110，P=0.002]。(見表3)。

表3 形態(tài)學方法與MALDI-TOF MS聯(lián)合數(shù)據(jù)庫對絲狀真菌鑒定能力的比較Tab.3 Comparison of the performance of morphological method and MALDI-TOF MS with the combined database in identification of filamentous fungi isolates n(%)

3 討 論

數(shù)據(jù)庫的完備與更新是保障MALDI-TOF MS實現(xiàn)病原微生物準確鑒定的重要前提。對于絲狀真菌，明確菌株種屬信息有助于區(qū)分潛在致病菌及污染菌。本研究將41株具有臨床代表性的絲狀真菌進行MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫，顯著提升實驗室對絲狀真菌分離株的鑒定能力。

Bruker MALDI-TOF MS商業(yè)絲狀真菌數(shù)據(jù)庫中包含127種絲狀真菌參考質(zhì)譜圖，但其菌種涵蓋范圍與臨床絲狀真菌分離譜存在一定偏差。用于本研究MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫的41株25種絲狀真菌中有9株5種在Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫中缺乏參考質(zhì)譜圖。另一方面，Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫采用絲狀真菌液體培養(yǎng)法生長的菌絲進行建庫，對待鑒定菌株建議進行20 h液體培養(yǎng)，或在絲狀真菌固體培養(yǎng)菌落較幼稚時進行MALDI-TOF MS鑒定；菌落成熟后其質(zhì)譜圖較幼稚菌落時存在差異性特征峰，導致此時Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫鑒定效果稍遜[17-18]，這與國內(nèi)大多數(shù)微生物實驗室絲狀真菌培養(yǎng)鑒定流程不相符。本研究參照《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定數(shù)據(jù)庫專家共識》，對固體培養(yǎng)法絲狀真菌幼稚菌落和成熟菌落分別進行MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫處理，得到的參考質(zhì)譜圖可以基本滿足常規(guī)工作中絲狀真菌鑒定需求。采用236株絲狀真菌臨床分離株對該自建數(shù)據(jù)庫進行性能評估，自建數(shù)據(jù)庫以及自建庫聯(lián)合Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫的鑒定能力均優(yōu)于Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫，其中以聯(lián)合數(shù)據(jù)庫的鑒定能力最為出色，種水平鑒定率76.3%(180/236)，另有19.1%(45/236)菌株可實現(xiàn)屬水平鑒定，僅4.6%(11/236)菌株無法鑒定。對于聯(lián)合數(shù)據(jù)庫下45株僅實現(xiàn)屬水平鑒定的菌株，經(jīng)與基因測序鑒定結(jié)果比對，有44株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果在種、屬水平均正確但鑒定分值介于1.700～1.999之間，如何將這一部分菌株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果提升至種水平鑒定范疇值得后續(xù)進一步探討。Sleiman等[19]研究表明，下調(diào)種水平鑒定截斷值至≥1.800可顯著提高Bruker商業(yè)數(shù)據(jù)庫對絲狀真菌的鑒定能力，但對自建數(shù)據(jù)庫以及聯(lián)合數(shù)據(jù)庫的鑒定能力影響較??；更新數(shù)據(jù)庫參考質(zhì)譜圖較下調(diào)種水平鑒定截斷值更能有效提高MALDI-TOF MS對絲狀真菌的鑒定能力。

形態(tài)學方法因其操作簡便、低成本等特點在絲狀真菌菌種鑒定方面仍占有重要地位，特別是對于臨床常見的具有特征性結(jié)構的絲狀真菌，如煙曲霉、構巢曲霉等，形態(tài)學方法多能實現(xiàn)種水平鑒定。但是對于少見或缺乏特征性結(jié)構的絲狀真菌，亦或因患者接受抗真菌藥物治療致使分離菌株形態(tài)發(fā)生變異，此時形態(tài)學方法易出現(xiàn)無法鑒定或錯誤鑒定的情況，需要借助基因測序技術或MALDI-TOF MS鑒定菌株信息。本研究中，55株曲霉少見種和非曲霉絲狀真菌經(jīng)形態(tài)學方法有30.9%(17/55)菌株鑒定至種水平，但種水平鑒定錯誤率較高(47.1%，8/17)。采用MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫，61.8%(34/55)菌株可實現(xiàn)種水平鑒定且無錯誤鑒定情況，種水平鑒定率及準確率均顯著高于形態(tài)學方法。此外，MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫在絲狀真菌菌種鑒定的檢測時長和檢測成本上也具有一定優(yōu)勢，特別是建立包含菌株不同生長階段的參考質(zhì)譜圖，可以對不同時段的臨床分離菌株進行鑒定；自建數(shù)據(jù)庫的檢測能力雖不及基因測序技術，但檢測成本及可操作性要優(yōu)于基因測序技術，適合在臨床常規(guī)工作中開展。

綜上，MALDI-TOF MS自建數(shù)據(jù)庫有助于提高實驗室絲狀真菌鑒定能力，特別是對于形態(tài)學方法鑒定困難的少見絲狀真菌。對自建數(shù)據(jù)庫進行不斷完善和菌種擴充是保證該技術滿足臨床菌種鑒定需求的重要助力。