李云超，魏思敏，田啟明，趙 昕，李金貴*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省高校動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

植物是許多現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的重要來源。約25%的現(xiàn)代藥物來源于植物，但僅有5～15%的植物被研究過其藥用價(jià)值[1]。目前，天然植物、中草藥或藥用植物、功能性食品得到了廣泛的研究，在糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗菌活性等方面獲得了一些很有價(jià)值的治療藥物[2-4]。

在藥用植物中，五倍子(Gallachinensis，GC)作為一種傳統(tǒng)中藥材已有上千年的使用歷史，對(duì)腹瀉、痢疾、敗血癥、炎癥、齲病等多種疾病有防治作用，還有抗癌、抗生育、抗氧化等功效[5]。GC的水提取物(aqueous extract of GC, GCE)含有大量的單體和聚合多酚，如沒食子酸單寧(Gallotannin, GT)、沒食子酸(gallic acid, GA)和沒食子酸甲酯(Methyl gallate, MG)以及一些碳水化合物、蛋白質(zhì)和其他成分[6]。目前已經(jīng)從GCE中鑒定了幾種化合物的分子結(jié)構(gòu)(圖1)[7,8]。GT是一種水解單寧，被認(rèn)為是GC的主要成分，其含量往往占五倍子干重的50%以上。GA又稱五倍子酸，化學(xué)名為3,4,5-三羥基苯甲酸，是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的天然多酚類化合物；MG為GA的衍生物。三者均已被證明具有抗氧化、抗炎、抗微生物等生物學(xué)活性[9,10]。結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究表明，GT抗氧化活性隨著沒食子?；鶖?shù)量的增加而增強(qiáng)，其中含6～7個(gè)沒食子?；腉T對(duì)傷寒沙門菌和蠟樣芽孢桿菌的抗菌活性最好[11]，且含量相對(duì)較高而被認(rèn)為是GCE抗菌活性的關(guān)鍵物質(zhì)。然而，少有研究對(duì)GT、GA和MG在GCE中的含量和抗菌作用進(jìn)行比較。為此，本研究采用大孔樹脂對(duì)GCE中GT進(jìn)行分離，同時(shí)收集脫GT后的剩余物(GTrE)，然后采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定兩者中GA和MG的含量，并比較各組分對(duì)臨床分離耐藥菌的抑制作用。

a. 五倍子單寧；b. 五倍子酸或沒食子酸；c. 沒食子酸甲酯圖1 五倍子中已知分子結(jié)構(gòu)的幾種化合物

2 材料和方法

2.1 菌株 大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)臨床分離株，由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院畜禽門診部王彥紅博士贈(zèng)予。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922和ATCC29213為本實(shí)驗(yàn)室保存株。

2.2 試驗(yàn)藥品 五倍子(Gallachinensis, GC)，購(gòu)自中國(guó)同仁堂藥店(中國(guó)揚(yáng)州)。試驗(yàn)用抗生素氨芐西林(AMP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢喹肟(CEF)、多西環(huán)素(DOX)、卡那霉素(KAN)、阿米卡星(AMK)、鏈霉素(STR)，環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、新霉素(NEO)和黏桿菌素(COL)等購(gòu)自上海吉智生化科技有限公司(中國(guó)上海)，分別以無菌蒸餾水或培養(yǎng)基中制備成新鮮儲(chǔ)備溶液。LB培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo ScientificTM。GT、GA和MG對(duì)照品購(gòu)自北京索拉比奧科技有限公司。HPLC級(jí)和分析級(jí)溶劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司。

2.3 五倍子提取物的制備 將GC粉碎成100目的粉末，稱取5.0 g加入50 mL去離子水中煎煮2 h； 將水煎液通過Whatman 1號(hào)濾紙以去除顆粒物，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，溶于無菌水中并調(diào)整濃度為0.5 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

2.4 大孔樹脂吸附法提取沒食子酸單寧(GT)和脫單寧剩余物 將2.3節(jié)方法獲取的水提物GCE裝載在大孔樹脂(XDA-6)柱上。XDA-6樹脂分離GT的最佳工藝參數(shù)如下：1)吸附條件：吸附溫度28 ℃、柱徑高比1∶8，進(jìn)料量2.0 bv，流速1.0 bv/h；2)解吸：洗脫溶劑為水溶液/乙醇(15∶85 v/v)，洗脫液體積2.0 bv，流速1.0 bv/h[13]。將分離出來的GT和脫GT剩余溶液結(jié)晶物(GTrE)分別收集、干燥、稱重后發(fā)現(xiàn)5 g GC粉末提取物中分離獲得的GT和GTrE分別為2.915 g和1.14 g。然后稱取適量并配制成相應(yīng)濃度的溶液與GA和MG等一起用于抗菌活性評(píng)價(jià)。

2.5 高效液相色譜法檢測(cè)GCE、GT和GTrE中GA和MG含量 所有標(biāo)準(zhǔn)品和試驗(yàn)樣品均在日本島津HPLC系統(tǒng)上檢測(cè)，色譜柱為Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，以甲醇(A)和0.5 % H3PO4水溶液(B)為流動(dòng)相。HPLC程序見表1所示；上樣體積為20 μL、柱溫為35 ℃。對(duì)于GA，設(shè)定流速為1 mL/min，流動(dòng)相A/B比例為15/85；對(duì)于MG，流速為0.5 mL/min，流動(dòng)相A/B比例為40/60，兩者的檢測(cè)波長(zhǎng)均為275 nm。

2.6 藥敏試驗(yàn)和藥物聯(lián)合作用的棋盤試驗(yàn) 使用微量肉湯稀釋法測(cè)定受試抗生素、GCE及其化學(xué)組分對(duì)上述兩種臨床分離菌株的MIC[14]。根據(jù)CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)解釋MIC結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922和ATCC29213作為試驗(yàn)質(zhì)控菌。

根據(jù)所測(cè)得的GT和GTrE對(duì)每種菌株的MIC值，采用棋盤稀釋法測(cè)定GT和GTrE的聯(lián)合的分級(jí)抑菌濃度(fractional inhibitory concentration, FIC)：即將GT和GTrE分別用鈣離子調(diào)節(jié)的無菌MH 肉湯倍比稀釋為2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC和1/32 MIC，各取50 μL分別排列在96孔板的行與列上，然后每孔加入100 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)試菌液，使菌液濃度為5×105CFU/mL，同時(shí)以無菌MH 肉湯作為陰性對(duì)照，不含藥物的稀釋菌液作為陽性對(duì)照，然后在37 ℃下培養(yǎng)16～20 h讀取結(jié)果，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。GT和GTrE之間的相互作用通過計(jì)算分?jǐn)?shù)抑制濃度指數(shù)(FICI)來確定。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：FICI≤ 0.5為協(xié)同作用；0.54.0，為拮抗作用[15]。同時(shí)設(shè)定陽性和陰性對(duì)照孔，每個(gè)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，并采用PRISM(6.0版)軟件進(jìn)行差異顯著分析，P<0.05時(shí)表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床分離菌的耐藥性測(cè)試結(jié)果 11種受試抗生素對(duì)E.coli和S.aureus臨床分離株的MIC測(cè)試結(jié)果見表1。根據(jù)CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)，這些菌株對(duì)11種抗生素表現(xiàn)出不同的耐藥性。在受試菌株中，4株臨床分離E.coli均對(duì)6種以上的抗生素表現(xiàn)出明顯的耐藥性；3株S.aureus則對(duì)受試的四種抗生素(STR、KAN、CIP、ENR)表現(xiàn)出耐藥性。這說明分離菌株均為多藥耐藥菌株。

表1 不同抗生素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌臨床分離株的MIC測(cè)定Tab 1 MICs of different antibiotics for clinical E. coli and S. aureus isolates.

3.2 GCE及其組分對(duì)E.coli和S.aureus的抑制作用比較 試驗(yàn)比較了大孔樹脂分離的GCE、GTrE和商品化GT、GA和MG對(duì)兩種臨床分離菌的抑菌作用，MIC測(cè)試結(jié)果見表3。GCE對(duì)E.coli和S.aureus菌株的MIC分別為8和0.25 mg/mL，即E.coli不同菌株的MIC是對(duì)S.aureusMIC的32倍，說明GCE對(duì)S.aureus的抑制作用較強(qiáng)，有一定的選擇性。商品化的GT與我們大孔樹脂分離的GT對(duì)兩種耐藥菌的抑制作用類似，且與GCE類似，都對(duì)S.aureus有較強(qiáng)的抑制作用。純品GA對(duì)E.coli的MIC與GCE接近，但對(duì)S.aureus的MIC則是GCE的20倍或40倍；MG也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，故GA和MG對(duì)S.aureus的抑制作用明顯低于GCE、GT。GTrE對(duì)兩種耐藥菌的抑制作用略強(qiáng)于GCE。

以上數(shù)據(jù)均顯示，GCE、GTrE、GT對(duì)S.aureus的抑制作用更強(qiáng)，而純品GA和MG對(duì)E.coli和S.aureus的MIC相似，GA和MG對(duì)S.aureus的抑制作用均明顯弱于GCE、GTrE、GT(表2)。

表2 GCE及其組分對(duì)大腸桿菌和金葡菌臨床分離株的MICsTab 2 MICs of GCE and its components for clinical E. coli and S. aureus isolates.

3.3 大孔樹脂分離GT與GTrE對(duì)兩種臨床分離菌的聯(lián)合作用 上述試驗(yàn)已證明GT和GTrE對(duì)兩種受試菌均具有明顯的抑菌作用，但兩者的聯(lián)合效應(yīng)還不清楚。本試驗(yàn)經(jīng)過FICI測(cè)定發(fā)現(xiàn)，除了對(duì)E.coli中的兩個(gè)分離株(E.coli0301E1-H2和E.coli0220E1-1)表現(xiàn)為無相互作用外，兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)其余菌株的抑制均顯示出相加作用(表3)。

表3 分離GT和GTrE對(duì)臨床分離株的分級(jí)抑菌濃度指數(shù)Tab 3 FICI of separated GT in combination with GTrE for clinical E. coli and S. aureus isolates.

3.4 GCE中GA和MG的HPLC定量測(cè)定 以濃度為X軸，峰面積為Y軸，繪制了GA和MG的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，得到回歸方程。兩者標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，說明線性關(guān)系良好。

圖2 GA(a)和MG(b)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Fig 2 Standard curve of GA (a) and MG (b), and their regression equation

GA和MG的線性范圍分別為2～50 μg/mL和0.5～10 μg/mL(表4)。根據(jù)圖2的回歸方程和樣品的峰面積計(jì)算不同提取物干燥樣品中GA和MG的含量百分比(表4)。結(jié)合前面表2的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)GCE對(duì)不同分離株E.coli的MICs為8 mg/mL，然而，GA在GCE中的含量?jī)H為3.1665%，這意味著GCE中GA的實(shí)際濃度為0.25 mg/mL；但純品GA對(duì)E.coli的MICs為5～10 mg/mL，這是GCE中GA實(shí)際濃度的20倍以上。與之相似的是，純品MG對(duì)受試菌株的MIC雖然略低于GA，但其在GCE中的含量更低，僅為0.0899%，實(shí)際濃度則為0.0072 mg/mL，純品MG對(duì)E.coli的MIC為2.5 mg/mL，是GCE中MG實(shí)際濃度的340多倍。結(jié)合表2中的數(shù)據(jù)，純品GA和MG對(duì)S.aureus的MIC均明顯高于GCE、GT和GTrE。這提示GA和MG應(yīng)該不是五倍子提取物抗菌活性的主要成分。

表4 GCE、分離GT和GTrE中GA和MG含量的測(cè)定Tab 4 Contents of GA and MG in GCE and its different extract.

4 討論與結(jié)論

目前，多藥耐藥菌的傳播速度比新藥創(chuàng)制的速度快，引起了較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)，從天然植物或中藥中篩選具有抗菌活性的提取物及其組合來替代現(xiàn)有抗菌藥已經(jīng)成為一種現(xiàn)實(shí)且有益的探索。近年來的研究表明，五倍子(GC)或其提取物具有很強(qiáng)的抗病毒、抗癌、保肝、止瀉和抗氧化活性[5]，在抗菌方面證明對(duì)大腸桿菌和變形鏈球菌生物被膜的形成具有顯著的抑制作用[16]。

盡管已有很多GC提取物抗菌活性的報(bào)道，但其活性成分的關(guān)聯(lián)性還沒有完全確定。對(duì)GC中有效成分結(jié)構(gòu)與抗菌效應(yīng)關(guān)系的初步研究表明，GC粗提物及其它成分具有顯著的防齲效果，由于粗提物含有多種化合物，其生物活性是多種化合物協(xié)同作用和/或拮抗作用的結(jié)果，故目前仍不清楚其確切的抗菌機(jī)制[8]。研究發(fā)現(xiàn)GCE和GTrE對(duì)兩種臨床分離耐藥菌均具有明顯的抗菌活性，兩者對(duì)臨床分離菌株(E.coli和S.aureus)的MIC相似，但它們對(duì)E.coli的MIC是S.aureus的32倍，說明GC提取物對(duì)S.aureus抑制作用的選擇性更強(qiáng)，因而有望用于防治S.aureus引起的感染。本研究使用大孔樹脂獲得的GT，干燥后稱重發(fā)現(xiàn)可達(dá)到GC干重的58.3%，與商品GT對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)E.coli和S.aureus具有相似的抑菌作用；脫單寧后剩余部分的干燥品，即GTrE，含量達(dá)到GC干重的22.8%，且其對(duì)兩種受試菌的抑制作用略好于GT。故推測(cè)GT和GTrE很可能是GC發(fā)揮抗菌作用的有效成分。

此外，研究還測(cè)定了GCE中GA和MG的含量，并檢測(cè)了其抑菌活性，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)E.coli的MIC與GCE或GT接近，但對(duì)S.aureus的作用明顯弱于GCE，分析兩者在GCE、GTrE中的含量發(fā)現(xiàn)，兩者在GCE和GTrE中含量有類似的規(guī)律，GA在GCE中的含量為3.16%左右，與報(bào)道的2～4%范圍一致[17]；而MG僅為0.0899%，比報(bào)道的含量略高[18]，故總體上看，兩者含量都比較低，在GCE中的濃度且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其純品的MICs(表4)。故可以推測(cè)GA和MG應(yīng)該不是GC提取物中的主要抑菌活性成分。

綜上所述，GCE與其中含量較高的GT對(duì)臨床分離耐藥大腸桿菌和金葡菌均有顯著的抑制作用，但對(duì)金葡菌的抑制作用更強(qiáng)，有望成為控制該菌感染的候選藥物；GA和MG雖具有抗菌活性，但在GCE中的含量很低，故可能不是主要的抗菌成分。除GT外，GC中還有未經(jīng)鑒定的化合物或其組合具有類似強(qiáng)度的抑菌作用，還需要進(jìn)一步研究。