錢玉玲，王維維，榮國強，成 蔚，單玲玲

（宿州學院，安徽宿州 234000）

蔓越莓，又稱蔓越橘，是杜鵑花科越橘屬的常綠小灌木，主要生長在北半球的涼爽地帶酸性泥炭土壤中，在中國大興安嶺地區(qū)也比較常見［1］.蔓越莓提取物含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質、無機鹽等，其中富含的原花青素，由于其特殊的抗氧化能力，可避免細胞被破壞并維持細胞的健康與活力［2］.原花青素是一種存在于自然中的天然多酚，其主要結構是兒茶素、表兒茶素或者二者之間的聚合體［3］，具有抗氧化、延緩人體衰老的作用，還可以治療消化系統(tǒng)疾病和尿道感染［4］，對糖尿病的治療也有輔助作用［5］.

從蔓越莓中提取原花青素的方法較多，如有機溶劑萃取法、微波輔助提取法、超聲波提取法、酶提取法［6］等.其中超聲波輔助提取法與其他方法相比更快捷，提取效率更高，操作簡單，安全并對環(huán)境友好［7?8］.本研究采用微波輔助提取法萃取蔓越莓中的原花青素，采用正交試驗優(yōu)選工藝條件來提高其提取率，并對其抗氧化性進行分析［9］，以期為我國蔓越莓資源的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎.

1 試驗材料與儀器

試驗材料蔓越莓為市售，原花青素標準品、丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚均為國藥集團分析純.

試驗儀器有HI84?SYW140 型電熱鼓風干燥箱，白山市玖久儀器儀表有限公司家；UV?2810 型紫外可見分光光度計，HITACHI 公司；DJ?10A 傾倒式粉碎機，上海隆拓儀器設備有限公司；KQ?2200B型超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ?D 循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；RE?501型旋轉蒸發(fā)器，鞏義市科瑞儀器有限公司.

2 試驗方法

2.1 蔓越莓的預處理

將蔓越莓洗凈，烘干，粉碎，過40目篩，石油醚脫脂，干燥備用.

2.2 提取工藝流程

蔓越莓粉末→加入提取劑→超聲波提取→抽濾→濃縮→冷凍干燥.

2.3 蔓越莓原花青素的鑒定

將原花青素標準品在紫外可見分光光度計的200～600 nm 波段掃描，檢測提取物與標準品波峰是否一致，以鑒定提取物是否屬于原花青素.

2.4 蔓越莓原花青素含量測定

2.4.1 標準曲線的繪制

準確稱取20.00 mg 原花青素標準品，用甲醇定容至10 mL，配制成質量濃度為2 mg/mL 的原花青素標準品溶液.分別吸取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL上述原花青素標準品溶液于7支具塞試管中，各加入甲醇定容至2 mL后，加入8.0 mL反應混合液（按體積比為正丁醇∶濃鹽酸∶10%硫酸鐵銨=83∶6∶1），蓋緊塞子，振蕩搖勻，于沸水浴中反應40 min，取出快速冷卻至室溫，以試劑空白為對照，在520 nm波長處測定吸光度.每組均測定3次后取平均值，記錄數據，以吸光度值為橫坐標，原花青素的濃度為縱坐標，繪制出標準曲線，得回歸方程.

2.4.2 蔓越莓原花青素得率的計算

準確吸取1.0 mL 定容后的蔓越莓原花青素浸提液，測定其在520 nm 波長處的吸光度值，根據標準曲線方程計算出樣品濃度，蔓越莓原花青素得率的計算公式為：

式中：C為蔓越莓原花青素的濃度（μg/mL）；V 為稀釋后的原花青素溶液總體積（mL）；M 為樣品的質量（μg）.

2.5 單因素試驗和正交試驗

分別考察超聲波輔助提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度4 種因素對蔓越莓原花青素提取率的影響.其中超聲波輔助提取時間分別為20、30、40、50 min；提取溫度分別為40、50、60、70℃；料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；乙醇濃度分別為25%、50%、75%、100%.

根據單因素試驗結果，對每個因素選擇合適的水平，應用正交表見表1，開展L9（34）正交試驗，根據收率得出蔓越莓原花青素的最佳提取工藝.

表1 正交試驗因素水平

2.6 蔓越莓原花青素抗氧化能力測試

取1.0 mL 最優(yōu)提取工藝下提取出的蔓越莓原花青素抽濾液，稀釋10倍，分別加入1%，2%，3%，4%濃度的氧化劑雙氧水和過硫酸鉀各1.0 mL，混合均勻，使其暴露于空氣中，室溫下放置30 min，測定含量.

取1.0 mL 最優(yōu)提取工藝下提取出的蔓越莓原花青素抽濾液，稀釋10 倍，分別加入0.5%，1.0%，1.5%，2.0%濃度的還原劑硫酸亞鐵和硼氫化鈉各1.0 ml，混合均勻，使其暴露于空氣中，室溫下放置30 min，測定含量.

3 實驗結果與分析

3.1 提取時間對蔓越橘中原花青素提取效果的影響

從圖1可以看出，當超聲波提取的時間變長時，從蔓越莓中所得原花青素的得率先增大后減小，當提取時間為40 min時，原花青素得率為最大值，即已經達到最大提取效率，若繼續(xù)延長提取時間，原花青素得率反而會降低.這可能是因為原花青素的結構不穩(wěn)定，提取時間過長會使一部分的原花青素的結構遭到破壞而分解［10］，故40 min為最優(yōu)提取時間.

圖1 提取時間對蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.2 提取溫度對蔓越莓中原花青素提取效果的影響

從圖2 可得，當超聲波提取溫度升高的時候，原花青素的得率先升高后降低.當提取溫度為60℃時，原花青素得率為最大值，如果繼續(xù)增高超聲波提取溫度，會造成花青素結構被破壞，原花青素得率反而會降低.這是可能因原花青素是易氧化物質，結構不是特別穩(wěn)定，溫度過高時，原花青素的結構會被破壞，溫度越高，原花青素被破壞的越多，故60℃為最優(yōu)提取溫度.

圖2 提取溫度對蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.3 料液比對蔓越莓中原花青素提取效果的影響

從圖3 可以看出，當料液比增加時，所得原花青素的得率先升高然后降低，當料液比為1∶30（g/mL）時，原花青素得率達到最大值，即提取效果最好，若繼續(xù)提高料液比，提取出的原花青素溶液濃度會變低，造成原花青素得率降低，并且會浪費提取溶劑，故1∶30（g/mL）為最佳料液比.

圖3 料液比對蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.4 乙醇濃度對蔓越莓中原花青素提取效果的影響

從圖4 可以看出，當乙醇濃度增加時，所得原花青素的得率先升高后降低.當乙醇濃度為50%時，原花青素得率為最大值，如果繼續(xù)增加乙醇的濃度，高濃度的乙醇可能會破壞原花青素分子.一定濃度的水進入植物的細胞之中會將有效成分提取出來，但非結合水的量太多，能溶于其中的雜質也會越多，這些雜質會對原花青素的提取造成干擾［11］，故50%濃度的乙醇為最適濃度.

圖4 乙醇濃度對蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.5 超聲波提取蔓越莓原花青素條件優(yōu)化

以4個單因素試驗結果為前提條件，開展L9（34）正交試驗，結果見表2.

表2 正交試驗結果

從表2 中的結果可知，4 個因素對試驗結果影響順序為：料液比>提取溫度>乙醇濃度>提取時間；蔓越莓中原花青素的最優(yōu)提取工藝為A2B3C1D2，即提取時間40 min，提取溫度70℃，料液比1∶20，乙醇濃度50%.

3.6 蔓越莓原花青素抗氧化、還原能力測試

3.6.1 雙氧水（H2O2）對蔓越莓原花青素的影響

從圖5 可以看出，在低濃度時雙氧水的氧化性對于蔓越莓原花青素結構的破壞作用并不明顯，當向原花青素溶液中加入2.0%濃度的雙氧水時，原花青素含量仍為9.10%，說明蔓越莓原花青素對雙氧水的氧化性有一定的抵抗力.

圖5 H2O2對蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

3.6.2 過硫酸鉀（K2S2O8）對蔓越莓原花青素的影響

從圖6可以看出，過硫酸鉀的氧化性對于蔓越莓原花青素的破壞作用并不明顯，當向原花青素溶液中添加2.0%濃度的過硫酸鉀時，原花青素含量仍為8.87%，說明蔓越莓原花青素對過硫酸鉀的氧化性有一定的抵抗力.

圖6 K2S2O8對蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

3.6.3 硫酸亞鐵（FeSO4）對蔓越莓原花青素的影響

由圖7可得知，當加入過硫酸鉀的濃度低于0.5%時，對蔓越莓原花青素結構的破壞作用并不明顯，但是超過0.5%時就會明顯的造成蔓越莓原花青素結構的破壞，當向原花青素提取液中加入2.0%濃度的硫酸亞鐵時，原花青素含量僅為0.02%，說明蔓越莓原花青素對還原劑硫酸亞鐵抵抗力較弱.

圖7 FeSO4對蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

3.6.4 硼氫化鈉（NaBH4）對蔓越莓原花青素的影響

從圖8可以看出，還原劑硼氫化鈉對蔓越莓原花青素有較大的破壞作用，硼氫化鈉的濃度為0.5%時，原花青素含量僅為2.23%，說明蔓越莓原花青素對還原劑硼氫化鈉完全沒有抵抗力.

圖8 NaBH4對蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

4 結論

本研究以蔓越莓為原料，利用安全并對環(huán)境友好的超聲波輔助提取法提取蔓越莓中原花青素，考察了提取時間、提取溫度、料液比，乙醇濃度4 個因素對于原花青素提取率的影響，并通過正交試驗對其提取進行優(yōu)化，得出最佳提取條件為：提取時間40 min，提取溫度70℃，料液比1∶20，乙醇濃度50%，該條件下，原花青素的提取率為11.65%.通過蔓越莓中原花青素抗氧化還原實驗研究表明：蔓越莓中原花青素對氧化劑的氧化性有一定的抵抗力，具有較好的抗氧化性；對于還原劑的還原性抵抗能力極弱，0.5%濃度的還原劑即可明顯破壞蔓越莓中原花青素的結構.