段懷洋,楊曜

(1.貴州省畢節(jié)市納雍縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，畢節(jié) 553300；2.貴州省畢節(jié)市納雍縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，畢節(jié) 553300)

金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在，50%以上健康人的皮膚上都存有金黃色葡萄球菌。而且其污染食品的機(jī)會(huì)很多[1]，常見的乳以及乳制品、蛋以及蛋制品、各類熟制品都有可能污染[2]。同時(shí)金黃色葡萄球菌在臨床上可以引發(fā)心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等疾病，占醫(yī)院感染病例的10%[3]。對(duì)于金黃色葡萄球菌感染最主要治療策略是抗生素，然而由于抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致出現(xiàn)大量的耐藥菌株尤其是耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)[4]。因此，對(duì)于金黃色葡萄球菌的潛在危害的研究以及對(duì)它的控制成為熱點(diǎn)。

噬菌體是一種能夠感染細(xì)菌的小病毒，可以通過對(duì)細(xì)菌的吸附達(dá)到自己繁殖的目的，同時(shí)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行裂解[5]。由于其這種專門吸附細(xì)菌的特性，是一種很好的細(xì)菌殺傷武器[6]。而且據(jù)報(bào)道已經(jīng)鑒定和描述的噬菌體超過6000種[7]，不難想象其作為一種豐富的資源，有待人們?nèi)ネ诰颉?/p>

近幾年，隨著細(xì)菌耐藥性的不斷嚴(yán)重，西方一些權(quán)威的研究機(jī)構(gòu)和業(yè)內(nèi)的專業(yè)人士開始重新審視噬菌體療法。一些公司已經(jīng)對(duì)天然的噬菌體展開了研究，如弗吉尼亞州的 Ampli Phi 生物科學(xué)中心，已經(jīng)在倫敦完成了一個(gè)包含 24 人的臨床研究，他們利用噬菌體療法成功治愈了綠膿桿菌感染引起的成人中耳炎[8]； Basdew和Laing利用3株噬菌體在體外有效治療金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳腺炎[9]。但是人們對(duì)于噬菌體治療的研究和了解還是有限，本文就已有的噬菌體知識(shí)進(jìn)行綜述，幫助更好的了解審視噬菌體。

1 噬菌體治療的發(fā)展歷史

1896年，Ernst Hankin報(bào)道了印度恒河和朱納河流域的霍亂弧菌的一種抗菌活性。兩年后，一位俄國(guó)細(xì)菌學(xué)家在研究枯草芽孢桿菌時(shí)，也描述了類似的情況。直到1915年，F(xiàn)rederick Twort推測(cè)病毒可能是這種抗菌活性的原因。英國(guó)細(xì)菌學(xué)家在嘗試脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)牛痘病毒時(shí)，注意到了微球菌“玻璃”菌落的生長(zhǎng)[10]。當(dāng)他在顯微鏡下觀察這些菌落時(shí)，他注意到有退化細(xì)菌的顆粒，由此闡明了他的假設(shè)。后來法裔加拿大微生物學(xué)家Felix d’Herelle繼續(xù)在噬菌體領(lǐng)域進(jìn)行了研究，他聲稱觀察到了“噬菌體現(xiàn)象”。在實(shí)驗(yàn)中，d’Herelle在瓊脂培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌菌落周圍的清晰區(qū)域，后來稱其為空斑。在他的發(fā)現(xiàn)(1919年)之后不久，其在巴黎醫(yī)院 des Enfants-Malades教授的監(jiān)督下，用噬菌體療法治療痢疾。在4例患者治療后，噬菌體的制備證實(shí)了其療效。然而，這些發(fā)現(xiàn)直到1931年才發(fā)表，這給了Richard Bruynoghe和Joseph Masin很大的啟發(fā)，使得他們后來報(bào)道了噬菌體在治療人類感染上的第一個(gè)應(yīng)用[11]。他們用噬菌體治療葡萄球菌性皮膚病。在這些重要的發(fā)現(xiàn)之后，微生物學(xué)家開始在動(dòng)物和人類的治療方面使用噬菌體。噬菌體治療領(lǐng)域的工作開始迅速發(fā)展。D 'Herelle建立了自己的實(shí)驗(yàn)室，生產(chǎn)了第一個(gè)商業(yè)噬菌體雞尾酒?？茖W(xué)家們?cè)诟鞣N感染上試驗(yàn)噬菌體;一項(xiàng)對(duì)21例傷寒患者的研究報(bào)告顯示，在使用噬菌體治療的情況下，死亡率從15.6%下降到4.8%，并發(fā)癥減少了43.2%。大量噬菌體成功治療試驗(yàn)的報(bào)道開始出現(xiàn)，如敗血癥、尿路感染、手術(shù)感染、皮膚感染、腹膜炎、耳鼻喉科感染，以及沙門氏菌相關(guān)結(jié)腸炎等。噬菌體治療熱潮已經(jīng)蔓延到美國(guó)，甚至著名的制藥公司，如Eli Lilly、Abbott Labs和E.R.Squibb，也開始生產(chǎn)治療噬菌體雞尾酒。在磺胺類抗生素和青霉素出現(xiàn)后，對(duì)噬菌體治療的興趣消退，在1934年Eaton和Bayne-Jones 的報(bào)告中，對(duì)噬菌體治療方案的準(zhǔn)確性和一致性提出質(zhì)疑[12]。而一些國(guó)家，如波蘭、格魯吉亞和俄羅斯，繼續(xù)在噬菌體治療領(lǐng)域進(jìn)行研究，至今仍使用噬菌體治療細(xì)菌感染。

2 噬菌體治療的優(yōu)點(diǎn)

噬菌體治療有許多優(yōu)點(diǎn)，使它成為一種非常有潛力的替代抗生素治療的藥品。首先，噬菌體對(duì)它們的宿主是非常特殊的，不像抗生素，它有更廣泛的宿主譜，可能會(huì)導(dǎo)致生物失調(diào)、繼發(fā)感染和其他副作用。而噬菌體只感染細(xì)菌細(xì)胞，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有影響，所以對(duì)宿主是沒有毒性的。此外，噬菌體在自然界中普遍存在，使得新噬菌體的分離和選擇相對(duì)于抗生素的發(fā)展來說是一個(gè)相對(duì)快速的過程，而抗生素的開發(fā)需要花費(fèi)數(shù)百萬(wàn)美元以及多年的研究來開發(fā)一種有效的抗生素藥物[13]。因此，與抗生素相比，噬菌體治療的發(fā)展階段相對(duì)便宜。耐藥性的發(fā)展是抗生素治療的一個(gè)重要問題，盡管細(xì)菌可能會(huì)對(duì)特定的噬菌體產(chǎn)生抗性，但總有一系列不同的噬菌體具有相同的靶點(diǎn)。同時(shí)，高頻率的突變使得噬菌體能夠與宿主共同進(jìn)化，通過強(qiáng)大的進(jìn)化壓力來克服任何獲得的抗性?？股夭⒉豢偸怯行У脑蛑皇撬鼈儽淮x并從體內(nèi)排出而沒有到達(dá)感染部位。噬菌體的優(yōu)勢(shì)在于，它們只能在宿主細(xì)菌的存在下進(jìn)行復(fù)制，并在系統(tǒng)管理后廣泛傳播到全身，從而到達(dá)感染部位。它們的微小尺寸允許它們滲透到藥物分子無法穿透的區(qū)域，例如血腦屏障。一些噬菌體甚至能夠滲透和破壞生物膜[14]。一旦在感染部位，噬菌體的指數(shù)增長(zhǎng)可能會(huì)比抗生素治療所需要的治療次數(shù)少，且劑量更低。

同時(shí)噬菌體對(duì)宿主菌有依賴性，只在宿主菌感染部位發(fā)生作用，并在宿主菌體內(nèi)迅速增殖，能在細(xì)菌感染的整個(gè)過程中發(fā)揮作用，隨著宿主菌的清除而死亡，不會(huì)在體內(nèi)殘留[15]。另外，根據(jù) Carlton 的報(bào)道，烈性噬菌體通過在細(xì)菌體內(nèi)的不斷復(fù)制和循環(huán)代謝到很長(zhǎng)時(shí)間之后能夠?qū)ο鄳?yīng)細(xì)菌產(chǎn)生適應(yīng)性的變異從而變的能夠裂解更多的細(xì)菌，但是自身依舊具有對(duì)細(xì)菌強(qiáng)烈的裂解能力，這也就意味著噬菌體的適應(yīng)能力和感染效率能夠得到提高，而傳統(tǒng)抗生素不具備這種優(yōu)勢(shì)。

而且噬菌體治療現(xiàn)在不僅局限于自己本身治療，其表達(dá)的裂解酶也是一種很好的治療手段。噬菌體裂解酶是由噬菌體感染細(xì)菌的后期由噬菌體基因組編碼合成的一種細(xì)胞壁水解酶，有選擇性、快速的殺滅特定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[16]。肽聚糖作為革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，對(duì)維持細(xì)菌內(nèi)部的正常滲透壓起著至關(guān)重要的作用，如果肽聚糖遭到破壞可以直接導(dǎo)致細(xì)菌的滲透性損傷和細(xì)菌崩解。而且裂解酶用于治療具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：第一，具有高度的特異性，大多數(shù)具有種屬特異性，這主要是由于不同細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖成分有差異；第二，具有快速、高效的特點(diǎn)，一旦裂解酶與肽聚糖上的底物接觸，就可以在極短的時(shí)間內(nèi)將處于靜態(tài)或生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)菌殺滅；第三，可以有效的治療生物被膜引起的心內(nèi)膜炎等感染；第四，可以與針對(duì)細(xì)胞壁起作用的抗生素發(fā)揮協(xié)同作用；第五，可以使抗性菌株恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性[17]。

3 噬菌體治療的缺點(diǎn)

3.1噬菌體方面 盡管使用噬菌體作為抗菌素治療有明顯優(yōu)勢(shì)，但也有不少挫折。其中之一是缺乏適當(dāng)記錄的臨床研究。目前還沒有關(guān)于治療方法、劑量、頻率和持續(xù)時(shí)間的既定協(xié)議。我們對(duì)噬菌體體內(nèi)行為的了解非常有限。已經(jīng)有人提出，在人體內(nèi)部，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)可能會(huì)顯著減少噬菌體的數(shù)量，從而減少與病原體對(duì)抗的可能性[18]。此外，噬菌體中和抗體的出現(xiàn)可能會(huì)阻礙噬菌體對(duì)抗目標(biāo)細(xì)菌病原體的能力。在波蘭，對(duì)57例細(xì)菌感染患者進(jìn)行的一項(xiàng)研究記錄了這一現(xiàn)象，在對(duì)噬菌體進(jìn)行了腸道輔助治療，這項(xiàng)研究在當(dāng)?shù)睾涂诜幤陂g是否會(huì)發(fā)生還沒有定論。從理論上講，噬菌體中和抗體的發(fā)展不應(yīng)成為噬菌體治療的重要障礙，因?yàn)槭删w的吸附和裂解動(dòng)力學(xué)應(yīng)該比宿主的抗體產(chǎn)生更快。另一個(gè)問題是噬菌體處理細(xì)胞內(nèi)病原體的功效。盡管如此，據(jù)報(bào)道，噬菌體成功地預(yù)防了沙門氏菌病和沙門氏菌生物膜產(chǎn)生[19]。長(zhǎng)期的噬菌體治療的副作用仍然未知。此外，沒有足夠的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)，噬菌體制劑的純度和穩(wěn)定性是可疑的。安全和語(yǔ)言障礙阻礙了科學(xué)家在俄羅斯和波蘭的期刊上解釋實(shí)驗(yàn)程序。自然，噬菌體在它們的目標(biāo)宿主范圍內(nèi)是高度特異性的，它可能包括整個(gè)物種的成員，或者是一個(gè)物種內(nèi)的一些菌株。這一特性既有消極的方面，也有積極的方面，它有助于避免對(duì)微生物群落的負(fù)面影響，以及在發(fā)現(xiàn)和消滅目標(biāo)病原體方面的障礙。檢測(cè)一種可能導(dǎo)致患者病情惡化的病原體，是需要耗費(fèi)大量時(shí)間的。使用噬菌體雞尾酒，它包含許多不同的噬菌體，涵蓋了廣泛的潛在毒株，是解決這一問題的一種方法。用于噬菌體治療的噬菌體應(yīng)僅由毒性噬菌體，而非溫帶噬菌體組成，以避免致病性特征的水平轉(zhuǎn)移[20]。了解許多不同類型的噬菌體的確切行動(dòng)模式并不是一件簡(jiǎn)單的事情，因?yàn)槭删w在體內(nèi)條件下的表現(xiàn)可能與體外的不同。在孟加拉國(guó)進(jìn)行的一項(xiàng)針對(duì)急性細(xì)菌性腹瀉兒童的隨機(jī)試驗(yàn)表明，口服的噬菌體未能在腸道內(nèi)擴(kuò)增，導(dǎo)致腹瀉發(fā)作的發(fā)生沒有改變[21]。為了闡明噬菌體在體內(nèi)的作用機(jī)制，還需要進(jìn)行更多的噬菌體治療試驗(yàn)和藥物動(dòng)力學(xué)研究。

3.2細(xì)菌方面 正如細(xì)菌可能對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性一樣，它們也可能通過一系列機(jī)制對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗藥性。這些包括在細(xì)菌細(xì)胞上對(duì)噬菌體表面受體進(jìn)行修飾，將噬菌體的基因組與細(xì)菌的基因組整合，并丟失特定于噬菌體復(fù)制或組裝的基因[22]。具有機(jī)制如下：

3.2.1物理阻隔 細(xì)菌細(xì)胞外結(jié)構(gòu)不僅有利于細(xì)菌在惡劣環(huán)境中存活，對(duì)阻止噬菌體侵染也起一定作用。如某些固氮菌可產(chǎn)生藻酸鹽，增加細(xì)菌對(duì)噬菌體的抵抗。此外，許多細(xì)菌的莢膜如鏈球菌中的透明質(zhì)酸也可以抵御噬菌體的侵蝕[23]。

3.2.2吸附抑制 噬菌體吸附宿主菌的部位和受體不同，由此決定了噬菌體的宿主特異性。這些受體包括細(xì)菌表面的磷壁酸、多糖、脂多糖或蛋白質(zhì)等。還有一些噬菌體吸附于宿主菌的菌毛，如銅綠假單胞菌噬菌體 MPK7 和 M22 可以利用Ⅳ型菌毛作為它們的受體，當(dāng)銅綠假單胞菌缺乏 pilA 基因時(shí)，可以產(chǎn)生對(duì)噬菌體 MPK7 和 M22 的抵抗[24]。

3.2.3注入阻滯 注入阻滯是由質(zhì)粒或前噬菌體編碼的蛋白發(fā)揮阻滯 DNA 注入宿主菌的作用，是細(xì)菌抗噬菌體的第二層手段。溫和噬菌體整合入細(xì)菌宿主染色質(zhì)中后，具有抵抗同種或有近緣關(guān)系的噬菌體重復(fù)感染的能力，這個(gè)過程稱為超感染排除(superinfection exclusion，Sie)[25]。

3.2.4限制—修飾系統(tǒng)(Restriction-Modification，R-M)是細(xì)菌一種廣泛地針對(duì)靶向DNA的免疫系統(tǒng)。到目前為止，在已測(cè)序的細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，超過 90% 都含有 R-M系統(tǒng)[26]。

3.2.5流產(chǎn)感染系統(tǒng) 流產(chǎn)感染(abortive infection，Abi)是指當(dāng)噬菌體成功注入 DNA 后，其繁殖受到阻斷，導(dǎo)致子代噬菌體繁殖和釋放失敗，從而避免其他細(xì)菌被噬菌體感染。與其他抵抗機(jī)制相比，這種系統(tǒng)在摧毀噬菌體的同時(shí)最終會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)菌的死亡，但是通過這種犧牲個(gè)體的方式可以保護(hù)細(xì)菌群體[27]。

3.2.6CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR在近一半細(xì)菌和所有的古細(xì)菌中都存在。CRISPR序列也成為目前基因改造和基因緘默的工程工具[28]。當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌，一些細(xì)菌會(huì)在靠近 CRISPR 序列前導(dǎo)區(qū)處插入一段和噬菌體序列一致的間區(qū)序列，當(dāng)相同噬菌體再次感染時(shí)，細(xì)菌的CRISPR-Cas相關(guān)基因產(chǎn)物(CRISPR-associated proteins)，利用間區(qū)序列介導(dǎo)產(chǎn)生一種CRISPR RNA 前體轉(zhuǎn)錄子(pre-crRNA)，之后被加工成小的CRISPR RNA 分子(crRNA)，利用類似 RNA干擾(RNA-interference-like)的機(jī)制啟動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)菌崩解入侵的噬菌體核酸[29]。

4 噬菌體在治療金黃色葡萄球菌感染方面的可行性

4.1細(xì)菌方面分析 金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性球菌，屬于微球菌屬[30]。由于其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏菌細(xì)胞壁的不同，噬菌體對(duì)其進(jìn)行裂解時(shí)只需要分泌表達(dá)裂解酶就可以對(duì)其進(jìn)行裂解[31]，不需要進(jìn)行其他步驟。而且金黃色葡萄球菌現(xiàn)在面臨的主要問題是抗生素耐藥性的產(chǎn)生，還沒有細(xì)菌產(chǎn)生針對(duì)噬菌體裂解酶抗性機(jī)制的研究報(bào)道[32]。另外，有報(bào)道對(duì)金黃色葡萄球菌用亞最小抑制濃度的裂解酶時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生對(duì)裂解酶表現(xiàn)抗性的突變菌株。在實(shí)驗(yàn)中，將噬菌體裂解酶滴到長(zhǎng)有金葡菌菌苔的平板上，然后在空斑的邊緣處挑取單菌落繼續(xù)培養(yǎng)后再次涂平板滴裂解酶，如此重復(fù)操作40個(gè)循環(huán)，即便如此，仍然沒有抗性菌株出現(xiàn)[33]。在另一項(xiàng)研究中，體外使 MRSA 菌株暴露于遞增濃度梯度的特異性裂解酶 Cly S 或者莫匹羅星，結(jié)果8d之后產(chǎn)生了具有低水平莫匹羅星抗性的突變菌株，而沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)裂解酶具有抗性的突變株。盡管金黃色葡萄球菌可以形成生物被膜，但是這不能阻礙裂解酶發(fā)揮其裂解活性[34]。

4.2噬菌體方面分析 細(xì)菌進(jìn)化的同時(shí)，噬菌體也跟著細(xì)菌進(jìn)化。如面對(duì)固氮菌產(chǎn)生的藻酸鹽，噬菌體F116 會(huì)產(chǎn)生一種藻酸鹽裂解酶，解除藻酸鹽的物理阻隔。一些噬菌體還可以通過產(chǎn)生多糖裂解酶或多糖水解酶來裂解胞外多糖(EPS)[35]，消除生物膜的阻礙作用。噬菌體還可通過多種方式逃避 R-M系統(tǒng)，如靶序列突變、抑制限制性內(nèi)切酶、合成可以水解 R-M因子的酶 (如 AdoMet )。博得特菌(Bordetella spp)噬菌體編碼自身甲基轉(zhuǎn)移酶差異反轉(zhuǎn)錄因子 (diversity-generating retroelements，DGRs)，通過 DGRs使噬菌體與不同的細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)相互作用，促進(jìn)噬菌體的吸附。面對(duì)流產(chǎn)感染機(jī)制，噬菌體orf38 基因的突變可以使其避免AbiQ[36]。對(duì)于CRISPR-Cas免疫而言，噬菌體僅通過原型間隔序列單點(diǎn)突變可克服這種免疫，如噬菌體通過自身編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾宿主的抗病毒系統(tǒng)，完成裂解循環(huán)[37]。

5 結(jié)論與展望

隨著金黃色葡萄球菌耐藥性越來越嚴(yán)重，人們急需一種新的治療手段來對(duì)付金黃色葡萄球菌。通過對(duì)噬菌體治療的優(yōu)缺點(diǎn)分析以及治療可行性分析，我們不難發(fā)現(xiàn)，雖然噬菌體治療存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，但是其治療的優(yōu)越性是顯而易見的，如果我們的研究技術(shù)能夠更先進(jìn)，未來噬菌體治療金黃色葡萄球菌感染方面將得到很好的應(yīng)用。而且現(xiàn)在人們將目光更多的聚焦于裂解酶治療，其作為一種蛋白，具有更廣的宿主譜，且不易產(chǎn)生抗性，同時(shí)更容易研發(fā)成制劑，配合抗生素使用，將會(huì)有很好的效果，也是未來研發(fā)的一個(gè)主方向。