朵紅,張學(xué)勇,馬怡雋,付永,沈秀英,郭志宏,更求久乃,馬國柱,王小紅,李劍,宋仁德,陳有錄,林芳明,王欣玥

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.青海省稱多縣獸醫(yī)站，稱多 815100；3.青海省祁連縣獸醫(yī)站，祁連 810400;4.青海省貴南縣獸醫(yī)站，貴南 813100；5.青海省玉樹市獸醫(yī)站，玉樹 815000)

棘球蚴病(Echinococcosis) 又稱包蟲病(Hydatidosis)，由寄生在狐貍、犬和狼等終宿主的棘球絳蟲(Echinococcus)成蟲排出的蟲卵，污染環(huán)境，動(dòng)物和人誤食后，蟲卵在體內(nèi)孵化成幼蟲引起的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。棘球蚴病在世界范圍內(nèi)流行[1-3]，我國是發(fā)病率較高的國家之一，西北地區(qū)的廣大農(nóng)牧區(qū)是我國包蟲病的主要流行區(qū)，尤其是青藏高原。由于其特殊的生態(tài)環(huán)境和氣候條件，牛、羊等家畜是廣大牧民群眾賴以生存的基礎(chǔ)，同時(shí)，青藏高原也是野生動(dòng)物繁衍生息的場(chǎng)所。棘球絳蟲在人、家畜、野生動(dòng)物之間混合感染，形成特殊的生活史循環(huán)鏈。青藏高原不僅是世界上棘球蚴感染較高的地區(qū)，而且有些地區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲混合感染[4,5]。

青海省分布著三種狐貍即赤狐、沙狐和藏狐[6,7]。在生態(tài)系統(tǒng)中它們與許多嚙齒類、兔形目等動(dòng)物構(gòu)成了多房棘球絳蟲的循環(huán)鏈[8]；藏狐和高原鼠兔間構(gòu)成石渠棘球絳蟲的循環(huán)鏈[9]。在青海省的牧區(qū)，野生狐貍活動(dòng)范圍與家畜的牧場(chǎng)重疊，野生狐貍排出的糞便污染草原環(huán)境，牛羊等草食動(dòng)物采食被蟲卵污染的牧草、水源后，感染上棘球蚴病。隨著國家野生動(dòng)物保護(hù)法的實(shí)施，野生狐貍數(shù)量增加，狐貍又是多房棘球絳蟲的主要重要終末宿主，為進(jìn)行棘球絳蟲野生宿主的防治，對(duì)野生狐貍棘球絳蟲感染調(diào)查顯得尤為重要。

為掌握青海省野生狐貍棘球絳蟲感染狀況，我們應(yīng)用棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒，對(duì)收集于青海省稱多縣、貴南縣、祁連縣的野生狐貍糞便進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品

于2018年4月至2020年4月，在青海省稱多縣收集狐貍糞便129份，祁連縣收集狐貍糞便84份，貴南縣收集狐貍糞便47份。

1.2 試劑盒和儀器

1.2.1試劑盒

棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，天禾生物技術(shù)研究院(珠海)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：110200402，生產(chǎn)日期：2020年4月2日。

1.2.2儀器

多功能酶標(biāo)儀(SYNERGY2,美國BioTek公司生產(chǎn))。

1.3 方法

1.3.1樣品處理

實(shí)驗(yàn)前，需將糞樣置于-80℃凍存至少15d以上。取糞樣約1g放入盛有1mL樣品稀釋液的試管中，振蕩使糞樣混懸，3000rmp離心10min，取上清進(jìn)行檢測(cè)。如離心后不能吸取上清的糞樣，可增加1mL稀釋液重懸后再離心。

1.3.2夾心ELISA檢查法

取出試劑盒平衡至室溫，包被板孔中加入處理后樣品100uL。陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各加1孔，臨界對(duì)照加3孔，留一孔不加樣品作為空白對(duì)照。置37℃ 6min。洗板機(jī)洗板3次，洗板結(jié)束將微孔板倒置在吸水紙上拍干。每孔加酶標(biāo)記物50uL，置37℃ 30min。洗板3次，每孔加顯色液A/B各50uL，震蕩混勻，置37℃ 避光30min。每孔加入終止液50uL(1滴)，混勻后用酶標(biāo)儀讀數(shù)。以空白孔調(diào)零，450nm波長測(cè)定OD置。

1.3.3結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)成立條件是陰性對(duì)照OD值<臨界對(duì)照OD值平均值，臨界對(duì)照OD值平均值>0.15，陽性對(duì)照OD值>0.50，證明實(shí)驗(yàn)成立，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，需重新實(shí)驗(yàn)。結(jié)果判定,陰性：樣品OD值/臨界對(duì)照OD值平均值<1.0，陽性：樣品OD值/臨界對(duì)照OD值平均值≥1.0

2 結(jié)果

用于試驗(yàn)的3個(gè)試劑盒陰性對(duì)照OD值分別為：0.196,0.107，0.066，臨界對(duì)照OD值平均值分別為：0.379，0.404，0.315，陰性對(duì)照OD值<臨界對(duì)照OD值平均值，臨界對(duì)照OD值平均值都>0.15，陽性對(duì)照OD值分別為：3.766，3.478，3.222，陽性對(duì)照OD值>0.50，試驗(yàn)成立。

稱多縣收集的129份狐貍糞便，經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)15份陽性，陽性率11.6%；祁連縣收集的84份狐貍糞便，經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)3份陽性，陽性率3.6%；貴南縣收集的47份狐貍糞便，經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)0份陽性，陽性率0。經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的共260份狐貍糞便中陽性18份，平均陽性率7.5%。

表1 棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果

3 討論

糞抗原檢測(cè)法操作簡便、方便易行、敏感性高，是目前棘球蚴病防治效果考核的重要方法，已在實(shí)踐中應(yīng)用多年，但用該方法檢測(cè)野生動(dòng)物糞便的報(bào)道較少。對(duì)收集于青海省3個(gè)地區(qū)的260份狐貍糞便，用棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒檢查出陽性糞便18份，陽性率7.5%，3個(gè)地區(qū)中稱多縣收集的狐貍糞便陽性率最高達(dá)11.6%，祁連縣收集的狐貍糞便陽性率較低為3.6%，貴南縣收集的狐貍糞便中沒有發(fā)現(xiàn)陽性。稱多縣收集的狐貍糞便陽性率大于其它2個(gè)地區(qū)。王虎等[10]1995—2005年在青海省青南高原區(qū)調(diào)查124只狐貍，27只感染棘球蚴，感染率21.8%，祁連山地和河湟谷地區(qū)調(diào)查24只狐貍，9只感染棘球絳蟲，感染率37.5%。我們于2011—2012年收集解剖青海省海晏縣、貴南縣、稱多縣、剛察縣36只狐貍，4只感染棘球絳蟲，感染率11.1%[11]。李清德等[12]對(duì)民和縣南大山林區(qū)收集的狐貍和狼的糞便用犬糞包蟲抗原檢測(cè) ELISA試劑盒進(jìn)行了檢查，結(jié)果狐貍糞陽性率為27.5%。說明青海省野生狐貍上棘球絳蟲感染率較高，在棘球蚴防治中應(yīng)加強(qiáng)野生終末宿主的防治。

棘球絳蟲糞抗原檢測(cè)試劑盒的微孔板表面包被的是抗細(xì)粒棘球絳蟲單克隆抗體，可以與被檢樣品中的細(xì)粒棘球絳蟲抗原形成抗體—抗原復(fù)合物，加入抗細(xì)粒棘球絳蟲單克隆抗體酶標(biāo)記物，形成免疫復(fù)合物，加入顯色液后發(fā)生顏色反應(yīng)，顏色的強(qiáng)度與待測(cè)樣品中的棘球絳蟲抗原的含量成正比。該檢測(cè)方法應(yīng)用細(xì)粒棘球絳蟲單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲也應(yīng)該有較高的檢出率。有報(bào)道顯示糞抗原檢測(cè)方法對(duì)2種棘球絳蟲(細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲)的鑒別準(zhǔn)確率為87%～95%[13]。由于青海省存在細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、石渠棘球絳蟲的感染，下一步，我們將對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽性的糞便進(jìn)行PCR檢查和LAMP檢測(cè)，以綜合評(píng)價(jià)糞抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)青海省野生狐貍糞便棘球絳蟲感染的檢查效果。