劉志鵬，于志勇，遲 良，胡學(xué)遠(yuǎn)，劉煥奇

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

奶牛酮病主要是由于機體能量供給和支出出現(xiàn)負(fù)平衡（Negative energy balance，NEB），導(dǎo)致糖脂代謝紊亂引發(fā)的營養(yǎng)代謝性疾病之一[1-2]。調(diào)查研究顯示，全球亞臨床酮癥患病率為24%[3]，我國酮病發(fā)病率約為15%～30%，且呈現(xiàn)逐年升高趨勢[4]，不僅威脅奶牛健康，也制約奶牛業(yè)發(fā)展。奶牛通常在產(chǎn)犢后5～6周進入泌乳高峰期，但其采食高峰期和食欲恢復(fù)一般在產(chǎn)犢后8～9周，特別是高產(chǎn)奶牛泌乳初期，能量代謝往往處于負(fù)平衡，極易造成能量代謝機能障礙[5-6]。此時，泌乳所需能量、脂肪和蛋白質(zhì)需求增加，而干物質(zhì)攝入量低于產(chǎn)奶所需能量，為滿足產(chǎn)奶需要，奶牛會動員體脂供能。大量體脂動員，使脂肪被水解為甘油和非酯化脂肪酸（Non-esterified fatty acid，NEFA）并釋放入血液，轉(zhuǎn)運到其他組織被氧化利用，當(dāng)血液中NEFA超出細(xì)胞需求量時，過剩的NEFA會轉(zhuǎn)運到肝臟進一步代謝。NEFA在肝臟被酯化成丙酮，導(dǎo)致奶牛發(fā)生高酮血癥，血液中酮體過度累積會引起奶牛食欲不振，進一步加重奶牛NEB狀態(tài)[7]。同時，肝細(xì)胞中過量NEFA無法被及時氧化利用，產(chǎn)生大量氧自由基及活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成肝臟氧化應(yīng)激損傷，加重酮病病情。

L-肉堿參與脂肪酸氧化及促進脂質(zhì)代謝氧化。在脂肪代謝過程中，L-肉堿作為載體與酯酰CoA結(jié)合成酯酰肉堿，將長鏈脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)，最終釋放出酯酰CoA參與β氧化為細(xì)胞提供能量[8]。肉堿具有抗氧化特性，可在某些代謝紊亂中保護細(xì)胞免受有毒活性氧侵害[9]。肉堿可清除氧自由基，抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化[10]。L-肉堿可提高谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione-peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性，減輕因年齡增長而發(fā)生的過氧化損傷[11]；補充肉堿可恢復(fù)肝細(xì)胞肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ（Carnitine palmityl transferase-Ⅰ，CPT-Ⅰ）酶活性，恢復(fù)線粒體膜電位水平，減輕線粒體損傷，減少細(xì)胞凋亡[12]。L-肉堿作為一種抗氧化劑，可顯著提高機體抗氧化能力，減少氧化損傷，增強機體免疫力和抗病能力，但其可否對NEFA導(dǎo)致的肝臟氧化應(yīng)激損傷有保護作用鮮有報道。因此，本試驗通過建立NEFA誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞AML12氧化應(yīng)激損傷模型，探討L-肉堿對NEFA致AML12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護效果，旨在為酮病治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DME/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于美國Hy-Clone公司；油酸、亞油酸、棕擱酸、棕櫚油酸、硬脂酸均購自美國Sigma公司；52.6 mmol.L-1NEFA貯存液[配方：油酸1.375 mL（4.35 mmol.L-1）、亞油酸0.152 mL（0.49 mmol.L-1）、棕櫚酸0.818 g、棕櫚油酸0.151 mL（0.53 mmol.L-1）和硬脂酸0.410 g混于113 mL 0.1 mol.L-1KOH，60℃混勻至全部溶解；再加入7.5 mL預(yù)熱HCl溶液和67.8 mL雙蒸水混勻；用0.22μm濾器濾過除菌后于-20℃保存；20 mmol.L-1L-肉堿貯存液（配方：L-肉堿原粉購于美國Sigma公司，無菌稱取80.6 mg L-肉堿粉末加入加入25 mLDME/F12，濾過除菌后于-4℃保存）；丙二醛（MDA）檢測盒、過氧化氫酶（CAT）檢測盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、線粒體綠色熒光探針檢測試劑盒（Mito-Tracker Green)、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）均購于江蘇碧云天生物有限公司；其他化學(xué)試劑為均來自國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

AML12小鼠正常肝細(xì)胞系購置于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），STR鑒定正確。細(xì)胞復(fù)蘇后于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DME/F12完全培養(yǎng)基，5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測

生長于對數(shù)期AML12細(xì)胞消化重懸后，接種于96孔板，每孔加入0.7×105個細(xì)胞和200μL完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至占孔底80%～90%。測定細(xì)胞毒性時，每孔分別加入含終濃度為0、0.6、1.2和1.8 mmol.L-1NEFA完全培養(yǎng)液，于37℃孵育24 h；測定細(xì)胞增殖時，L-肉堿處理組加入終濃度為1.8 mmol.L-1（跟據(jù)預(yù)試驗篩選最適濃度）L-肉堿與適當(dāng)濃度NEFA溶液于37℃共孵育24 h。之后，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)2 h，于450 nm處測定各孔吸光值。每孔設(shè)置5個重復(fù)，確保試驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

1.3.2 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測定

MDA含量、T-SOD活性、CAT活性與GSH-Px活性測定：將生長于對數(shù)期AML12細(xì)胞，消化重懸后按每孔加入5×105個細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至50%～60%時，加入不同藥物處理，分為NEFA組（含終濃度為1.2 mmol.L-1NEFA，細(xì)胞毒性試驗得出最佳濃度）、L-肉堿組（含終濃度為1.8 mmol.L-1L-肉堿）和L-肉堿干預(yù)組（1.8 mmol.L-1L-肉堿+1.2 mmol.L-1NEFA），對照組加同等體積細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至80%～90%時收集各組細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿。于1 000 r.min-1離心10 min，棄置上清收集沉淀。向沉淀中加入1 mL PBS，充分混勻清洗細(xì)胞，反復(fù)2次。離心完成后，用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，于超聲細(xì)胞破碎儀中，充分破碎細(xì)胞。隨后根據(jù)MDA檢測盒及CAT、GSH-Px和T-SOD活性檢測試劑盒反應(yīng)體系和步驟作檢測；ROS含量檢測：根據(jù)ROS檢測試劑盒，待6孔板中細(xì)胞經(jīng)L-肉堿和/或NEFA處理后，生長至80%～90%時，每孔加入10μmo.L-1DCFH-DA熒光探針，與培養(yǎng)液混勻再培養(yǎng)60 min。之后消化細(xì)胞，重懸并用PBS洗滌2次，于1 000 r.min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀并用1×PBS重懸細(xì)胞，加入新的6孔板中，避光轉(zhuǎn)移至熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞熒光。

1.3.3 線粒體分布檢測

6孔板中細(xì)胞經(jīng)L-肉堿和/或NEFA處理后，取對數(shù)期AML-12細(xì)胞，吸除6孔板中全部培養(yǎng)液，改換為預(yù)先37℃溫浴的Mito-Tracker Green工作液，輕緩搖動使之分散均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。孵育完成后換為每孔2 mL完全培養(yǎng)液，避光移至熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)光波長為490 nm，發(fā)射波長為516 nm。

1.3.4 線粒體膜電位測定

根據(jù)線粒體膜電位檢測試劑盒，6孔板中細(xì)胞生長至80%～90%時，使用PBS洗滌1次。然后每孔加1 mL培養(yǎng)液與1 mL JC-1工作液，充分混勻后置于37℃培養(yǎng)箱孵育20 min。孵育結(jié)束后，吸除所有培養(yǎng)液，每孔加入2 mL預(yù)冷的JC-1染色緩沖液，輕搖洗滌細(xì)胞2次，每次3 min。清洗完成后去除JC-1染色緩沖液，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，避光轉(zhuǎn)移至熒光顯微鏡下，30 min內(nèi)完成觀察。檢測JC-1單體時，激發(fā)波長設(shè)置為490 nm，發(fā)射波長設(shè)置為530 nm；檢測JC-1聚合物時，激發(fā)波長設(shè)置為525 nm，發(fā)射波長設(shè)置為590 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism7.04軟件作差異性分析和作圖，使用Image J軟件對細(xì)胞熒光圖片作定量分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，配合Tukey事后檢驗。當(dāng)分析結(jié)果P＜0.05時，表明試驗結(jié)果差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-肉堿對NEFA致AML12細(xì)胞毒性的影響

細(xì)胞毒性檢測結(jié)果（見圖1）顯示，AML12細(xì)胞存活率隨NEFA濃度增加而降低，NEFA濃度在1.2 mmol.L-1（P＜0.01）、1.8 mmol.L-1（P＜0.01）時與對照組（0 mmol.L-1）相比均極顯著下降，表明高濃度NEFA具有明顯細(xì)胞毒性。因此，后續(xù)試驗選取1.2 mmo.L-1NEFA作為體外刺激濃度進行試驗。細(xì)胞增殖檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-肉堿單獨處理對細(xì)胞活性無顯著影響，而當(dāng)L-肉堿與NEFA共孵育時，細(xì)胞存活率較僅加入1.2 mmol.L-1NEFA組極顯著上升（P＜0.01），表明L-肉堿對NEFA造成的細(xì)胞毒性具有保護效果。

圖1 L-肉堿對NEFA致細(xì)胞毒性的影響Fig.1 Effect of L-carnitineon NEFA induced cytotoxicity

2.2 L-肉堿對NEFA致AML12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，NEFA處理后，細(xì)胞MDA含量極顯著升高（見圖2A，P＜0.01），T-SOD活性極顯著降低（見圖2B，P＜0.01），表明NEFA引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，L-肉堿對細(xì)胞MDA，TSOD水平無顯著影響，而在NEFA中加入L-肉堿共孵育組中，細(xì)胞MDA含量較單獨NEFA處理組極顯著降低（P＜0.01），T-SOD活性則呈現(xiàn)與MDA相反趨勢（P＜0.01），表明L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護效果。

圖2 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞MDA和T-SOD變化的影響Fig.2 Effect of L-carnitine on NEFA-induced MDA level and T-SOD vitality in AML 12 cells

抗氧化酶CAT和GSH-Px活性檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，NEFA極顯著降低肝細(xì)胞CAT（見圖3A，P＜0.01）和GSH-Px（見圖3B，P＜0.01）活性，進一步表明NEFA引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。L-肉堿對細(xì)胞CAT和GSH-Px水平無顯著影響，而在NEFA中加入L-肉堿共孵育組中，細(xì)胞CAT（P＜0.01）和GSH-Px（P＜0.01）活性極顯著增加，表明L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護效果。

圖3 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞CAT和GSH-Px變化的影響Fig.3 Effect of L-carnitine on NEFA-induced CAT level and GSH-Px vitality in AML 12 cells

為進一步證實L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用，本試驗檢測ROS含量。

如圖4所示，與對照組（見圖4A）相比，NEFA組（見圖4B）細(xì)胞熒光強度顯著增加，而L-肉堿組（見圖4C）細(xì)胞熒光強度不變；L-肉堿+NEFA共孵育組（見圖4D）熒光強度較NEFA單獨處理組熒光強度明顯降低。相對定量分析發(fā)現(xiàn)，L-肉堿+NEFA（見圖5）共孵育組極顯著降低NEFA引起ROS上調(diào)（P＜0.01），提示NEFA通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷；添加L-肉堿可減少NEFA誘導(dǎo)的ROS增加。

圖4 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞ROS變化的影響Fig.4 Effect of L-carnitineon NEFA-induced ROSlevels in AML 12 cells

圖5 定量分析L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞ROS變化的影響Fig.5 Quantitative analysis the effect of L-carnitineon NEFA-induced ROSlevelsin AML12 cells

2.3 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞線粒體分布變化的影響

在證實NEFA誘導(dǎo)AML-12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷基礎(chǔ)上，本試驗繼續(xù)探索L-肉堿對NEFA導(dǎo)致AML-12細(xì)胞線粒體損傷程度的影響。如圖6所示，對照組（見圖6A）中細(xì)胞綠色熒光均勻分布在胞質(zhì)中，NEFA組（見圖6B）中集中分布于細(xì)胞膜周邊，且熒光面積和強度顯著降低，細(xì)胞中出現(xiàn)黑色空洞，表明線粒體在受到NEFA刺激后，發(fā)生線粒體聚集，甚至有些線粒體失去活性。而在L-肉堿處理組（見圖6C），線粒體熒光分布與對照組相似，L-肉堿+NEFA共孵育組（見圖6D）熒光強度比單獨NEFA處理組熒光強度明顯升高。量化分析結(jié)果顯示，L-肉堿+NEFA共孵育組（見圖7）對比NEFA組，線粒體異常分布率顯著降低（P＜0.01），表明L-肉堿對NEFA造成的線粒體分布異常有保護作用。

圖6 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞線粒體分布變化的影響Fig.6 Effect of L-carnitine on NEFA-induced Mitochondrial distribution in AML 12 cells

圖7 定量分析L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞線粒體分布的影響Fig.7 Quantitative analysis the effect of L-carnitine on NEFA-induced Mitochondrial distribution in AML 12 cells

2.4 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響

NEFA誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，ROS主要產(chǎn)生部位為細(xì)胞線粒體，ROS大量升高引起線粒體膜電位異常，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此本試驗檢測L-肉堿對NEFA導(dǎo)致AML-12細(xì)胞線粒體膜電位變化。由圖8可知，NEFA組（見圖8B）高線粒體膜電位紅色熒光較對照組（見圖8A）和L-肉堿處理組（見圖8C）減少，而低線粒體膜電位綠色熒光增加，表示NEFA可降低線粒體膜電位。但與NEFA組相比，經(jīng)L-肉堿處理后（見圖8D）細(xì)胞紅色熒光明顯增強，綠色熒光明顯減弱，表明L-肉堿可以改善NEFA介導(dǎo)的線粒體膜電位降低。相對定量分析發(fā)現(xiàn)（見圖9），NEFA組紅/綠平均熒光強度比率與對照組（P＜0.01）和L-肉堿處理組（P＜0.01）相比均極顯著降低，表明NEFA可降低細(xì)胞線粒體膜電位。而添加L-肉堿后，與NEFA單獨處理組相比，紅/綠平均熒光強度比率顯著升高（P＜0.05），表明添加L-肉堿可改善NEFA對線粒體膜電位的抑制作用。

圖8 L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響Fig.8 Effect of L-carnitineon NEFA-induced mitochondrial membranepotential changes in AML 12 cells

圖9 定量分析L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響Fig.9 Quantitative analysisthe effect of L-carnitine on NEFA-induced mitochondrial membrane potential changes in AML12 cells

3 討論

奶牛酮病主要特征性之一為NEFA顯著升高，其已被作為預(yù)測酮病發(fā)生有效指標(biāo)[13]。研究顯示，酮病奶牛體內(nèi)NEFA與SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性呈負(fù)相關(guān)，與MDA、H2O2等氧化應(yīng)激指標(biāo)變化呈正相關(guān)。同時NEFA也被證實可引起奶牛肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。因此，本試驗建立起小鼠肝細(xì)胞（AML12）NEFA暴露模型，研究L-肉堿對NEFA致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用。

本試驗中，NEFA在1.2 mmol.L-1時可顯著降低小鼠肝細(xì)胞AML12細(xì)胞活性，說明此濃度可引起顯著細(xì)胞毒性。王興慧等研究證實NEFA可通過抑制PGC-1α表達，引起肝臟脂代謝酶基因表達紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂蓄積[15]。董記紅等研究中，1.2 mmol.L-1NEFA造成犢牛肝細(xì)胞SOD活性顯著降低，MDA水平顯著上升[16]。Li等研究表明1.2和2.4 mmol.L-1NEFA組LDH釋放顯著增加，GSH-Px含量顯著降低，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高[17]。因此，本試驗結(jié)合細(xì)胞毒性試驗，最終選取1.2 mmol.L-1濃度進行后續(xù)試驗。NEFA濃度選擇不同可能與細(xì)胞種屬差異有關(guān)，但從小鼠和牛肝細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)NEFA可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

肉堿為一種廣泛存在于生物體內(nèi)的類維生素氨基酸衍生物，其在調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、氧化還原反應(yīng)、炎癥信號傳導(dǎo)等眾多生理功能中起重要作用[18]。研究表明，L-肉堿預(yù)處理可顯著提高氧化應(yīng)激細(xì)胞模型T-AOC，抗氧化劑水平（T-GSH、GSH），同時提高抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活力[19]。L-肉堿在氧化應(yīng)激恢復(fù)中起重要作用[20]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEFA可上調(diào)小鼠肝細(xì)胞AML-12 MDA水平，降低抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，而添加L-肉堿可提高SOD、CAT、GSH-Px活性以及減少MDA含量，與上述研究結(jié)果基本相似。SOD活力能一定程度反映細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)和清除活性氧的能力，常與MDA檢測相互參照，利用MDA含量驗證細(xì)胞受活性氧侵害損傷程度，二者聯(lián)合鑒定細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。添加L-肉堿后，SOD活力相對于NEFA單獨處理組有明顯提高，可能是L-肉堿利用其氧化還原特性直接消耗掉部分O-，亦補充L-肉堿直接或間接激活其他抗氧化酶活化途徑，但仍需進一步驗證。

線粒體為ROS主要產(chǎn)生部位。酮癥奶牛NEB狀態(tài)導(dǎo)致肝細(xì)胞中NEFA處于高代謝狀態(tài)，其在線粒體氧化過程中會產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-22]。研究表明，在奶牛肝細(xì)胞中，ROS水平和凋亡率以NEFA劑量依賴性方式增加。高濃度NEFA可產(chǎn)生過量ROS，導(dǎo)致單核細(xì)胞氧化應(yīng)激，說明NEFA可通過線粒體釋放大量ROS，進而破壞氧化/抗氧化平衡，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)NEFA誘導(dǎo)大量ROS產(chǎn)生，而添加L-肉堿后，細(xì)胞中ROS熒光強度明顯降低。ROS定量分析結(jié)果也顯示相似結(jié)果，說明L-肉堿可顯著降低NEFA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。結(jié)合MDA含量與SOD、CAT、GSH-Px活力變化，推斷出L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有一定保護作用。

線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞正常功能至關(guān)重要[23]。氧化應(yīng)激引起線粒體功能紊亂，線粒體功能障礙包括線粒體膜電位改變，線粒體數(shù)量減少以及由于細(xì)胞和組織中ROS積累而導(dǎo)致其氧化蛋白活性改變[24]。NEFA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可損傷線粒體功能，進一步對細(xì)胞造成損傷，最終導(dǎo)致肝功能異常。利用熒光探針Mito-Tracker Green標(biāo)記線粒體細(xì)胞內(nèi)分布，結(jié)果顯示NEFA處理降低肝細(xì)胞細(xì)胞綠色熒光面積和強度，表明線粒體在受到NEFA刺激后，肝細(xì)胞線粒體發(fā)生聚集，甚至有些線粒體失去活性，而添加L-肉堿共孵育后細(xì)胞熒光強度較單獨NEFA處理組明顯升高，表明L-肉堿對NEFA造成的線粒體分布異常有一定程度保護作用。對線粒體膜電位檢測也有類似結(jié)果，NEFA處理肝細(xì)胞后，線粒體膜電位明顯降低，而添加抗氧化劑L-肉堿可穩(wěn)定NEFA導(dǎo)致的線粒體膜電位下降。結(jié)合ROS變化和線粒體分布結(jié)果，更加確證L-肉堿對NEFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護作用，可以考慮將其作為飼料添加劑應(yīng)用于奶牛酮病的預(yù)防及輔助治療。但本試驗未使用奶牛肝細(xì)胞進行驗證因此存在一定局限性，后續(xù)仍需在牛肝細(xì)胞和酮病奶牛中開展相關(guān)研究。

4 結(jié)論

本試驗從體外證實NEFA可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞線粒體損傷，引起細(xì)胞ROS釋放，造成細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性下降，MDA水平顯著升高，最終導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；L-肉堿可通過穩(wěn)定線粒體膜電位、改善線粒體異常分布，從而減少細(xì)胞ROS釋放、提高SOD、CAT、GSH-Px活性和減少MDA含量，保護NEFA致小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。