關(guān)思靜，王 楠，徐蓉蓉，葛甜甜，高 靜，彭 亮，張 崗，陳 瑩

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 / 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心, 陜西 咸陽(yáng) 712046；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) / 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 陜西 咸陽(yáng) 712083）

烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)為豆科多年生草本植物，其根及根莖富含黃酮類、三萜類以及多糖等活性物質(zhì)，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化等藥理作用，是一種常用的中草藥[1-2]。甘草不僅具有較高的藥用價(jià)值，而且具有很強(qiáng)的固沙能力，是西北干旱地區(qū)重要的植物資源[3]。但是，近年來(lái)隨著人們對(duì)甘草需求的日益增長(zhǎng)，導(dǎo)致其野生資源逐漸枯竭，人工栽培成為解決甘草資源危機(jī)的可能途徑之一。然而有研究表明，人工栽培甘草其抗逆性低于野生甘草[4]，且質(zhì)量參差不齊。因此，提高甘草抗旱性及品質(zhì)是目前甘草種植產(chǎn)業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

干旱是一種外界的逆境脅迫，已經(jīng)成為藥用植物生產(chǎn)力的主要限制因素之一。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累，引起膜脂的廣泛過(guò)氧化和去酯化，并使蛋白質(zhì)變性和核酸突變[5]。在生物進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了一套減少或消除ROS 的保護(hù)酶系統(tǒng)，包括過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxide, POD)等[6]。研究表明，植物遭受干旱脅迫時(shí)還會(huì)提高抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，如小麥(Triticum aestivum)根系中ROS 代謝相關(guān)基因谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase 7, GPX7)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶3 (ascorbate peroxidase 3,APX3)、谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferases 8, GST8和Glutathione S-transferase 18,GST18)和GSTU11(Glutathione S-transferase 11)在干旱脅迫下均顯著上調(diào)[7]。

土壤干旱會(huì)導(dǎo)致植物根部產(chǎn)生脫落酸(abscisic acid, ABA)，根源信號(hào)ABA 到達(dá)葉片，進(jìn)而促進(jìn)氣孔關(guān)閉，減少CO2的進(jìn)入，抑制光合作用[8]。除此之外，干旱脅迫也能通過(guò)葉綠素降解、光化學(xué)系統(tǒng)損壞等造成光合速率下降[9]。Gleason 等[10]在研究玉米(Zea mays)對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其光合特性、水力傳導(dǎo)以及氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance, Gs)均大幅降低。雷蕾和張彥妮[11]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫降低了黃連花(Lysimachia davurica)的凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、蒸騰速率(transpiration rate, Tr)和Gs，同時(shí)提高了胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)。

植物適應(yīng)逆境脅迫的響應(yīng)包含形態(tài)、生理生化和分子上的改變，這些改變又是眾多基因表達(dá)改變而引起的。參與抗旱的重要基因一般分為兩大類：功能基因和調(diào)節(jié)基因，前者編碼重要的代謝蛋白和酶，直接保護(hù)植物細(xì)胞免受干旱脅迫的侵害；后者則編碼調(diào)控蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等，這些蛋白主要在脅迫響應(yīng)中進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和綜合調(diào)控下游應(yīng)答基因[12]。值得注意的是，其中轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)ABA 依賴/獨(dú)立的途徑被激活，參與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在植物抵御干旱脅迫中扮演著重要角色[13]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，研究藥用植物在轉(zhuǎn)錄組水平上與抗旱性相關(guān)的特定基因表達(dá)和分子機(jī)制已十分普遍。如李鉑等[14]研究結(jié)果表明，以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)模擬干旱脅迫下半夏(Pinellia ternata)莖中編碼植物激素與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原相關(guān)酶等基因表達(dá)水平顯著上升；李曉艷等[15]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了在適度干旱脅迫下，bHLH (basic-helix-loop-helix)、bZIP(basic leucine zipper)、MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子在丹參(Salvia miltiorrhiza)根和葉中差異表達(dá)均顯著，且可能參與調(diào)控萜類基因的表達(dá)，這為研究中藥材對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供了豐富的基因信息。本研究旨在對(duì)干旱脅迫下甘草光合生理、抗氧化酶活性的變化進(jìn)行分析，并利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序方法，分析干旱脅迫對(duì)甘草不同部位基因表達(dá)的調(diào)控特征，以期為進(jìn)一步篩選抗旱相關(guān)基因、提高甘草干旱脅迫耐受性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理?xiàng)l件

烏拉爾甘草種子購(gòu)自峰華農(nóng)業(yè)有限公司。挑選健康飽滿的種子浸泡在體積比為1 ? 3 的30%過(guò)氧化氫 ? 純凈水溶液中消毒30 min，洗凈后，放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，適量加水后于25 ℃恒溫氣候箱中進(jìn)行催芽萌發(fā)。待子葉完全展開(kāi)，挑選生長(zhǎng)一致的幼苗移至塑料水培盆中，以純凈水澆灌幼苗培養(yǎng)24 h，更換后采用Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液水培4 周。隨后處理組用Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液配制15%聚乙二醇(polyethylene glycol 6000, PEG-6000)溶液模擬干旱脅迫[16]，以不加PEG-6000 的Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對(duì)照組。處理時(shí)間均為7 d。各處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定方法

分別于脅迫處理0 (CK)、1、3、5、7 d 時(shí)，選取各處理植株完全展開(kāi)葉用CIRAS-3 光合儀測(cè)定葉片Pn、Gs、Tr、Ci4 項(xiàng)光合作用參數(shù)，設(shè)定葉室面積1.7 cm2，光強(qiáng)[1 200 μmol?(m2?s)?1]；相對(duì)葉綠素(soil and plant analyzer develotrnent, SPAD)值采用TYS-3N 型植物營(yíng)養(yǎng)測(cè)定儀測(cè)定；SOD、POD、CAT 活性分別采用氮藍(lán)四唑(nitroblue tetrazolium, NBT)光還原法、愈創(chuàng)木酚-分光光度法和紫外吸收法測(cè)定[17]。測(cè)定結(jié)束后，取剩余幼苗地上和地下部分用液氮速凍于? 80 ℃冰箱中。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

將保存于-80 ℃冰箱中的幼苗樣本做好標(biāo)記，委托杭州景杰生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序分析。去除原始數(shù)據(jù)中含有接頭和低質(zhì)量的序列，并根據(jù)堿基質(zhì)量值進(jìn)行修剪，得到clean reads。與甘草參考基因組進(jìn)行比對(duì)后，使用RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)法對(duì)reads counts 進(jìn)行均一化處理，進(jìn)而評(píng)估基因的表達(dá)量。差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P< 0.05、|log2FC| > 1。同時(shí)對(duì)篩選得到的DEGs 進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)代謝途徑分析。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Coalition Building Institute,NCBI)網(wǎng)站Blastp 在線工具，對(duì)差異表達(dá)倍數(shù)最高的前10 個(gè)DEGs 進(jìn)行比對(duì)分析，并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行功能注釋。

1.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析

根據(jù)基因注釋信息，分別從甘草地上和地下部分的DEGs 中篩選出次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因，并利用植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/)鑒定DEGs 中潛在的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)鑒定的轉(zhuǎn)錄因子與次級(jí)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理，利用SPSS 21 對(duì)生理指標(biāo)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，并使用Origin 2017 繪圖，采用Cytoscape 3.7.1 軟件繪制轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)甘草光合生理特性的影響

2.1.1 光合參數(shù)變化

正常供水條件下，甘草的Pn為9.55 μmol?(m2?s)?1，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，甘草的Pn呈持續(xù)降低趨勢(shì)，脅迫處理7 d 時(shí)降到最低[0.56 μmol?(m2?s)?1]，顯著低于其他處理時(shí)間(P< 0.05) (圖1)。甘草的Ci變化波動(dòng)較大，在干旱脅迫1 d 時(shí)，降到最低(208.38 μmol?mol?1)，至干旱脅迫7 d 時(shí)，Ci上升并達(dá)到最大(304.00 μmol?mol?1)。甘草的Gs在處理7 d 時(shí)降到最低，顯著低于其他處理時(shí)間，僅為正常供水組的10%。甘草的Tr變化趨勢(shì)同Gs相一致，在處理結(jié)束時(shí)降至最低[0.28 mmol?(m2?s)?1]。

圖1 干旱脅迫對(duì)甘草光合參數(shù)的影響Figure 1 Effects of drought stress on the photosynthetic parameters of Glycyrrhiza uralensis

2.1.2 相對(duì)葉綠素含量變化

甘草SPAD 值在干旱脅迫1 d 時(shí)顯著上升(P<0.05)，達(dá)到最大(39.72)，之后趨于平穩(wěn)，干旱脅迫1、3、5 d 時(shí)，各處理間無(wú)顯著差異(P> 0.05)，至干旱脅迫第7 天時(shí)顯著下降至36.58 (圖2)；各脅迫處理均顯著大于正常供水對(duì)照。

圖2 干旱脅迫對(duì)甘草相對(duì)葉綠素含量的影響Figure 2 Effects of drought stress on the relative chlorophyll content of Glycyrrhiza uralensis

2.2 干旱脅迫對(duì)甘草葉片和根中CAT、POD、SOD 活性的影響

干旱脅迫1 d 時(shí)，甘草葉片中CAT 活性顯著上升并達(dá)到最大(P< 0.05)，脅迫3 d 時(shí)降低，但之后隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐步升高的趨勢(shì)；根中的CAT 活性在干旱脅迫1 d 時(shí)顯著下降至最低，之后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在干旱脅迫7 d 時(shí)CAT 活性降低，但與正常供水對(duì)照相比無(wú)顯著差異(P> 0.05)(圖3)。甘草葉片中的POD 活性在干旱脅迫1 d 時(shí)下降至最低值，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)，并在干旱脅迫7 d 時(shí)達(dá)到最高；根中POD 活性在干旱脅迫7 d 時(shí)顯著高于正常供水對(duì)照(P< 0.05)，但與干旱脅迫1、5 d 之間無(wú)顯著差異(P> 0.05)。甘草葉片中SOD 活性變化平穩(wěn)，總體呈上升趨勢(shì)，在處理3 和7 d 時(shí)SOD 活性顯著高于正常供水對(duì)照(P< 0.05)；根中SOD 活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但與正常供水對(duì)照相比，處理1、3、5 d 之間的SOD 活性并無(wú)顯著差異(P> 0.05)，至干旱脅迫7 d 時(shí)顯著下降(P< 0.05)，為正常供水對(duì)照的42.49%。

圖3 干旱脅迫對(duì)甘草葉片和根中抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of drought stress on antioxidant enzyme activities in the leaves and roots of Glycyrrhiza uralensis

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

2.3.1 測(cè)序質(zhì)量結(jié)果

將對(duì)照組和干旱脅迫處理組甘草地上部分、地下部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)樣本設(shè)置3 次重復(fù)，獲得地上部分3 組對(duì)照組的平均clean reads 為43 119 552，Q20大于98.00%，Q30大于95.00%，GC 堿基比例大于45.00%；干旱脅迫組的平均clean reads 為45 638 526，3 組重復(fù)處理的Q20大于98.00%，Q30大于94.00%，GC 堿基比例大于46.00%。地下部分3 組對(duì)照組的平均clean reads 為43 037 220，Q20大于98.00%，Q30大于94.00%，GC 堿基比例大于46.00%；干旱脅迫組的平均clean reads 為42 059 404，3 組重復(fù)處理的Q20大于98.00%，Q30大于94.00%，GC 堿基比例大于47.00%。樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)Q30滿足標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)GC 含量接近，可以進(jìn)行后續(xù)生物信息分析。

2.3.2 地上部分和地下部分DEGs 表達(dá)分析

以|log2FC| > 1、P< 0.05 為DEGs 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組相比，干旱脅迫下甘草地上部分共檢測(cè)出7 500 個(gè)DEGs，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量3 649 個(gè)(48.65%)，下調(diào)表達(dá)基因3 851 個(gè)(51.35%) (圖4A)。甘草地下部分共檢測(cè)出5 298 個(gè)DEGs，其中上調(diào)表達(dá)基因3 087 個(gè)(58.27%)，下調(diào)表達(dá)基因2 211 個(gè)(41.73%) (圖4B)。分別有5 258 (49.81%)和3 056 個(gè)(28.95%) DEGs 是甘草地上和地下部分特異性表達(dá)的，2 242 個(gè)(21.24%) DEGs 是二者共有差異表達(dá)的(圖5)。在這2 242 個(gè)DEGs 中，共誘導(dǎo)表達(dá)283 個(gè)(12.62%)，抑制表達(dá)407 個(gè)(18.15%)，在地上部分和地下部分相反表達(dá)1 552 個(gè)(69.22%)。

圖4 干旱脅迫下甘草地上部分(A)和地下部分(B)差異表達(dá)基因火山圖Figure 4 Volcanic diagram of differentially expressed genes (DEGs) in aboveground part (A) and underground part (B) of Glycyrrhiza uralensis under drought stress

圖5 差異表達(dá)基因韋恩圖Figure 5 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs)

2.3.3 差異表達(dá)基因的GO 分類和顯著性富集分析

為探究干旱脅迫下甘草響應(yīng)基因的功能，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GO 功能富集分析，發(fā)現(xiàn)甘草地上和地下部分分別有6 008 和4 117 個(gè)DEGs 在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，其中地上部分的DEGs 分布于生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能三大類的52 個(gè)亞類中，地下部分的DEGs 分布于三大類的50 個(gè)亞類中。地上和地下兩部分的DEGs 在三大類的分布基本一致，均被顯著富集到細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、單一生物過(guò)程、刺激響應(yīng)、細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器、膜、結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等類別(圖6)。

圖6 差異表達(dá)基因基因本體富集分析Figure 6 Gene ontology (GO) enrichment analysis of the differentially expressed genes (DEGs)

通過(guò)Blastp 篩選出上調(diào)和下調(diào)基因中表達(dá)顯著的DEGs (表1)，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)甘草地上部分參與干旱脅迫應(yīng)答的基因主要有具有SOD 活性的胚樣蛋白(可能的)基因(Glyur000570s00022984)、在植物防御反應(yīng)中產(chǎn)生最多的蛋白之一致病相關(guān)蛋白1 基因(Glyur000270s00013309)、具有氧化還原活性的小檗堿橋酶8 基因(Glyur000005s00001103)、非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)的FAR1 相關(guān)序列(Glyur000132s00015956)和UPF0481 蛋白相關(guān)基因(Glyur000936s00037090)、與植物激素和次生代謝具有密切關(guān)系的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶88B1 基因(Glyur001034s00029013)以及控制胞漿離子濃度的陽(yáng)離子/ H + 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Glyur000160s00019165)等。地下部分參與干旱脅迫應(yīng)答的基因主要是增強(qiáng)蛋白質(zhì)多樣性的U1 小核核糖核蛋白A 基因(Glyur002700s00036100)、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂分化的ADP-核糖聚合酶基因RCD1(Glyur000341 s00020158)、能夠在細(xì)胞表面識(shí)別病原體和激活細(xì)胞內(nèi)防御信號(hào)的抗病蛋白R(shí)PP8基因(Glyur005334s00 043878)、調(diào)節(jié)茉莉酸激素信號(hào)的細(xì)胞色素P450 94B3基因(Glyur001736s00033407)以及控制植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的同源基因SBH1(Glyur000259s00016757)等。

表1 樣品中差異倍數(shù)前10 名基因Table 1 Top 10 genes with multi-fold differentiation in the specimens

2.3.4 差異表達(dá)基因的KEGG 途徑富集分析

為研究參與干旱脅迫響應(yīng)的DEGs 生物學(xué)行為，對(duì)其進(jìn)行了KEGG 代謝途徑分析，將P≤0.05 的通路定義為DEGs 顯著富集的通路。地上部分共有2 094 個(gè)DEGs 注釋到KEGG 代謝途徑中，其中最顯著富集的通路為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporters)，共有196 個(gè)DEGs，上調(diào)117 個(gè)，下調(diào)79 個(gè)；其次為轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors)，共有139 個(gè)DEGs，上調(diào)68 個(gè)，下調(diào)71 個(gè)；再次為蛋白激酶(protein kinases)，共有83 個(gè)DEGs，上調(diào)17 個(gè)，下調(diào)66 個(gè)(表2)。其他通路主要涉及生物合成，如苯丙烷類生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)等；代謝途徑如淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、?；撬岷蛠喤；撬岽x(taurine and hypotaurine metabolism)。甘草地下部分共385 個(gè)DEGs 注釋到KEGG 代謝途徑中，其中最富集通路為轉(zhuǎn)錄因子，共124 個(gè)DEGs，上調(diào)表達(dá)80 個(gè)，下調(diào)表達(dá)44 個(gè)；其次為蛋白激酶，共57 個(gè)DEGs，上調(diào)表達(dá)47 個(gè)，下調(diào)表達(dá)10 個(gè)；再次為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction，上調(diào)表達(dá)32 個(gè)，下調(diào)表達(dá)23個(gè)。其余代謝途徑包括甘草根中有效成分相關(guān)的代謝途徑苯丙烷類生物合成以及二萜類生物合成(diterpenoid biosynthesis)。進(jìn)一步分析相關(guān)代謝途徑之后發(fā)現(xiàn)保護(hù)酶系統(tǒng)重要成分谷胱甘肽代謝酶、過(guò)氧化物酶、抗壞血酸氧化酶相關(guān)基因在甘草地上、地下部分均有顯著響應(yīng)，其中尤以谷胱甘肽代謝酶為主，分別有6 和8 個(gè)相關(guān)DEGs 在干旱脅迫下顯著上調(diào)。

表2 差異表達(dá)基因顯著富集的京都基因與基因組百科全書(shū)代謝途徑Table 2 Significantly enriched Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways of differentially expressed genes (DEGs)

2.3.5 干旱脅迫對(duì)甘草次級(jí)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

對(duì)甘草轉(zhuǎn)錄組中的DEGs 分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫影響了甘草萜類、黃酮類等次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)(表3)。包括萜類生物合成的關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、1-脫氧-D-葡萄糖-5-磷酶還原異構(gòu)酶、11-氧-β-淀粉酶30 氧化酶；黃酮類生物合成限速酶查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶等。相關(guān)基因在地上部分上調(diào)表達(dá)28，下調(diào)表達(dá)17 個(gè)，在地下部分上調(diào)表達(dá)15 個(gè)，下調(diào)表達(dá)6 個(gè)，表明適度干旱脅迫促進(jìn)了甘草次級(jí)代謝途徑基因的表達(dá)。

表3 甘草中受干旱脅迫調(diào)控的次級(jí)代謝相關(guān)基因Table 3 Secondary metabolism-related genes regulated by drought stress in Glycyrrhiza uralensis

2.3.6 干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境脅迫中扮演著重要角色。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，地上和地下部分總共有264和226 個(gè)DEGs 被鑒定為轉(zhuǎn)錄因子，并分別屬于32和34 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。兩個(gè)組織部位中差異表達(dá)較多的轉(zhuǎn)錄因子類型主要是ERF (ethylene responsive transcription factors)、bHLH、C2H2 (C2H2-zinc-finger protein transcription factor)、Dof (DNA binding with one finger)、bZIP (basic leucine zipper)、MYB_related 等，其中ERF 的DEGs 數(shù)目最多(圖7)。地上部分WRKY、NAC (NAM/ATAF/CUC)、 TCP (teosinte branched I/Cycloidea/proliferating cell factor)等DEGs 的數(shù)量幾乎是地下部分的2 倍，地下部分中bHLH、MYB_related以及LBD (lateral organ boundaries domain)的DEGs 數(shù)目高于地上部分。在地上和地下部分中，有95 個(gè)共同差異表達(dá)的基因被鑒定為轉(zhuǎn)錄因子，分別有169和131 個(gè)特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，如EIL (ethylene insensitive3-like)、VOZ (vascular plant one-zinc-finger)、BES1 (BRI1-ethylmethylsulfone-suppressor 1)等在地上部分特異性表達(dá)，而在地下部分特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有RAV (related to ABI3/VP1)、WOX (WUSCHELrelated homeobox)以及SRS (SHI-related sequence)等。

圖7 干旱脅迫下差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Figure 7 Differentially expressed transcription factors in Glycyrrhiza uralensis under drought stress

利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系預(yù)測(cè)網(wǎng)站，對(duì)甘草次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因與差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地上和地下部分分別有19 和14 個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因存在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子家族分類，地上部分包括ERF(AT5G25390、AT2G 40340、AT5G67190、AT3G23240)、TCP (AT3G47620、AT1G53230、AT3G02150 )、MYB (AT1G79180、AT4G 38620、AT5G14340)、bHLH (AT2G22750)、bZIP (AT3G 30530)、NAC (AT1G71930)等轉(zhuǎn)錄因子(圖8A)。地下部分則是MYB (AT5G10280、AT5G08520、AT4G 38620)、C2H2 (AT5G04390)、TCP (AT3G47620、AT5G 51910)、bZIP (AT3G30530、AT3G62420)、WRKY (AT5G 52830、AT5G13080)等轉(zhuǎn)錄因子(圖8B)。

圖8 甘草地上部分(A)和地下部分(B)次級(jí)代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 8 Transcriptional regulatory network of genes related to secondary metabolic pathway in the aboveground part (A) and underground part (B) of Glycyrrhiza uralensis

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫會(huì)抑制植物光合作用的進(jìn)行，嚴(yán)重影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。幾乎所有的植物在遭受干旱脅迫時(shí)的第一反應(yīng)都是關(guān)閉氣孔以防止水分蒸發(fā)[18]。有研究認(rèn)為，由于氣孔的關(guān)閉和葉肉細(xì)胞光合能力的降低，導(dǎo)致干旱脅迫下大豆(Glycine max)的Pn、Gs降低，Ci升高[19]。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因在地上部分顯著上調(diào)，有研究表明NCED基因受干旱脅迫誘導(dǎo)，在過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中會(huì)上調(diào)內(nèi)源ABA 水平[20]。ABA 在植物抵御干旱脅迫的機(jī)制中作為一種化學(xué)信號(hào)，通過(guò)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉從而保存水分。此外，干旱脅迫下葉片的衰老加速了光合色素的降解，這也導(dǎo)致了Pn的下降[13]。在本研究中觀察到SPAD 值在不同干旱脅迫時(shí)間下呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，干旱脅迫初期SPAD 值的增加可能是由于植物生長(zhǎng)速率降低引起的集中效應(yīng)[21]，隨著脅迫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)最終導(dǎo)致SPAD 值下降。以上結(jié)果表明，甘草Pn下降可能是由于氣孔關(guān)閉以及葉綠素含量的降低共同導(dǎo)致的。

光合能力的下降可能會(huì)降低光合電子的傳遞速率，這有利于電子流向分子氧，從而導(dǎo)致植物產(chǎn)生超氧自由基，打破植物體內(nèi)ROS 的平衡[21]。干旱等非生物脅迫破壞植物細(xì)胞的代謝平衡，導(dǎo)致ROS 的含量增高，植物可以感知和評(píng)估體內(nèi)ROS 的水平，并調(diào)控相應(yīng)的基因表達(dá)，使ROS 和保護(hù)酶活性之間存在動(dòng)態(tài)平衡以響應(yīng)干旱脅迫。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，干旱脅迫對(duì)甘草地上和地下部分的多種保護(hù)酶基因均具有雙向調(diào)控作用，尤以谷胱甘肽代謝酶相關(guān)DEGs 表達(dá)最為顯著。谷胱甘肽代謝酶不僅是一種重要的ROS 清除劑，還發(fā)揮各種內(nèi)源和外源物質(zhì)的解毒作用[7,22]。本研究中也觀察到干旱脅迫結(jié)束時(shí)，甘草葉片中SOD 活性顯著增加，而根中CAT 活性無(wú)顯著差異，POD 活性顯著上升，SOD活性顯著降低。CAT 和POD 是清除H2O2分子的主要酶類[23]。CAT 主要負(fù)責(zé)分解H2O2，并與SOD 協(xié)同清除超氧自由基，而POD 則具有雙重作用，在清除H2O2的同時(shí)，將初期的過(guò)氧化物氧化為丙二醛，以便于保護(hù)酶將其徹底清除[24]。甘草葉片和根中3 種保護(hù)酶對(duì)水分虧缺的響應(yīng)不一致，表明在植物不同器官中，起保護(hù)作用的酶可能不同，不同器官對(duì)同一脅迫的反應(yīng)也有差異。

眾多研究表明，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能從mRNA 水平全面地反映物種基因功能及特定的生物學(xué)過(guò)程，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究干旱脅迫下植物的基因表達(dá)水平，有利于揭示植物的抗旱應(yīng)答機(jī)理[25]。本研究對(duì)干旱脅迫下甘草地上和地下部分轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序和DEGs 表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種組織中分別檢測(cè)出7 500 和5 298 個(gè)DEGs，其中共有2 242個(gè)DEGs 差異表達(dá)，1 552 個(gè)DEGs 相反表達(dá)。這些結(jié)果表明，甘草地上部分對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)比地下部分更敏感，并且在響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中兩種組織可能具有不同的發(fā)育軌跡，但功能注釋發(fā)現(xiàn)，地上和地下部分DEGs 在GO 功能部位中的分布基本一致，這與干旱脅迫下豌豆(Pisum sativum)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相似[12]。在分析顯著表達(dá)的DEGs 時(shí)，發(fā)現(xiàn)甘草地上、地下部分顯著表達(dá)的DEGs 主要涉及到植物防御、抗氧化酶活性、植物激素、植物生長(zhǎng)發(fā)育等生物過(guò)程，這表明甘草可能主要通過(guò)這些生物過(guò)程抵御干旱脅迫。對(duì)地上、地下兩部分中DEGs 的KEGG 途徑分析表明，干旱脅迫促進(jìn)逆境防御基因的表達(dá)，并且二者均在轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、細(xì)胞色素P450 等代謝途徑中顯著富集。有研究結(jié)果表明在適度干旱脅迫下，甘草有效成分合成相關(guān)的途徑中，一些關(guān)鍵酶基因在甘草根中上調(diào)表達(dá)[26]，這與本研究結(jié)果類似，DEGs 在有效成分合成途徑中得到了顯著富集并明顯上調(diào)表達(dá)，這可能是干旱脅迫促進(jìn)甘草活性成分積累的基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子是許多脅迫響應(yīng)基因的主要調(diào)控因子，可以增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。本研究結(jié)果表明干旱脅迫可以調(diào)控甘草多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其中ERF、bHLH、C2H2、MYB、TCP、WRKY等在地上和地下部分表達(dá)均較顯著。已有研究證實(shí)包括bZIP、AP2 / ERF(APETALA2/ethylene-responsive element binding factors)、NAC、bHLH、WRKY 和MYB等在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族參與干旱脅迫響應(yīng)[27-28]。其中，鑒定的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目最多的屬于AP2 /ERF 家族，有近85%的ERF 家族成員在地下部分中上調(diào)表達(dá)，75%的ERF 家族成員在地上部分中上調(diào)表達(dá)。有研究表明，ERF 轉(zhuǎn)錄因子可以作為正向調(diào)節(jié)劑，參與大豆逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而提高植株的耐旱性[28]。另一類差異表達(dá)數(shù)目較多的轉(zhuǎn)錄因子為MYB 家族。研究證實(shí)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的AtMYB2作為ABA 信號(hào)的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，在干旱脅迫下發(fā)揮重要作用[29]。在本研究結(jié)果中，有1 個(gè)共同表達(dá)的DEGs(Glyur000144s00012217)被鑒定為MYB2 轉(zhuǎn)錄因子，且在地上和地下部分中均被顯著上調(diào)，這表明MYB2 轉(zhuǎn)錄因子可能正向調(diào)節(jié)甘草干旱脅迫響應(yīng)。此外，C2H2、Dof 等鋅指轉(zhuǎn)錄因子在植物的發(fā)育以及抵抗非生物脅迫中同樣也具有重要意義[30]。不僅如此，轉(zhuǎn)錄因子還廣泛參與中藥次生代謝產(chǎn)物合成基因的調(diào)控[31]。目前已成功分離、鑒定了多個(gè)調(diào)控藥用植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的WRKY、MYB、ERF、bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子[32]。本研究結(jié)果中，干旱脅迫下，ERF、bHLH、NAC、MYB、WRKY 等轉(zhuǎn)錄因子在甘草地上和地下部分中均表現(xiàn)出誘導(dǎo)型表達(dá)，并與差異表達(dá)的次級(jí)代謝相關(guān)基因形成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，表明它們?cè)诟珊得{迫下參與調(diào)控甘草干旱脅迫應(yīng)答機(jī)制，可能是促進(jìn)干旱脅迫下甘草有效成分合成的調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，干旱會(huì)導(dǎo)致甘草Pn、Tr和Gs降低。葉片和根部通過(guò)誘導(dǎo)保護(hù)酶基因的表達(dá)以調(diào)節(jié)抗氧化酶活性的方式來(lái)清除ROS。干旱誘導(dǎo)了ERF、bHLH、NAC、MYB、WRKY 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響了次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑，為進(jìn)一步在分子水平上深入研究提高甘草抗旱性及發(fā)掘相關(guān)耐旱基因提供了參考資料。