孫韜華，閆泰山，黎維勇，陳安進(jìn)

(1.青島市市立醫(yī)院藥物臨床試驗研究科，青島 266011；2.青島市市立醫(yī)院藥學(xué)部，青島 266011；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022)

三七總皂苷為五加科植物三七的主根或根莖經(jīng)加工制成的總皂苷，2015年版《中華人民共和國藥典》中，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd進(jìn)行三七總皂苷的鑒定和含量測定[1]。三七總皂苷的制劑在臨床上應(yīng)用廣泛，其中三七總皂苷粉針可用于瘀血阻絡(luò)、卒中偏癱等癥。燈盞花素是從菊科植物短葶飛蓬中提取分離所得干燥粉末，其主要有效成分為野黃芩苷[1]，燈盞花素粉針在臨床上用于卒中及其后遺癥等的治療。從適應(yīng)證來看，三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針具有相近之處。前期動物實驗表明，三七總皂苷和燈盞花素聯(lián)合應(yīng)用，具有改善急性心肌缺血[2]、急性腦缺血癥狀[3]等功效，可以顯著降低腦梗死大鼠血清中誘導(dǎo)一氧化氮合酶的活力及總一氧化氮合酶的含量，與單藥組相比有明顯差別[4]。這一結(jié)果提示可對兩者聯(lián)合用藥進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā)。本實驗中，考察了二者制成的復(fù)方粉針(下文中簡稱為：復(fù)方粉針)在健康比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征，并與單方制劑三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1實驗動物 比格犬30只，雌、雄各半，體質(zhì)量(10.83±0.68) kg，安陸瑞克森實驗動物場提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0001。使用許可證號：SYXK(鄂)2010-0057。飼養(yǎng)于普通級環(huán)境，室溫18～29 ℃，相對濕度30%～75%，室內(nèi)光照明暗交替各12 h，單籠飼養(yǎng)，普通飼料投喂，自由飲用凈化水。

1.2藥品與試劑 三七皂苷R1(含量98.0%，批號：110745-200617)、人參皂苷Rg1(含量96.3%，批號：110703-201027)、人參皂苷Re(含量88.8%，批號：110754-200822)、人參皂苷Rb1(含量92.6%，批號：110704-200921)、人參皂苷Rd(含量94.4%，批號：111818-201001)、野黃芩苷(含量96.4%，批號：110842-200102)及內(nèi)標(biāo)替米沙坦(含量99.3%，批號：100629-200401)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。復(fù)方粉針(規(guī)格：每支含三七總皂苷125 mg，野黃芩苷5 mg，批號：20120816)、三七總皂苷粉針(規(guī)格：三七總皂苷125 mg/支，批號：20121023)、燈盞花素粉針(規(guī)格：野黃芩苷5 mg/支，批號：20121101)均由麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研制。色譜純甲醇、乙腈購自德國Merck公司；色譜純乙酸銨購自廣州迪馬公司；實驗用水為超純水。

1.3儀器與設(shè)備 LC-30AD型液相色譜系統(tǒng)，QTRAN 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；梅特勒AB-265S型精密天平(感量：0.01 mg)；XW-80A微型渦旋混合儀；Thermo BR4i型高速離心機(jī)；ANNEL DC-12氮吹儀；UNT優(yōu)普超純水機(jī)。

1.4動物分組、給藥和血樣采集 30只健康比格犬采用SAS9.4編寫隨機(jī)程序，按照1：1：1隨機(jī)分成復(fù)方粉針組、三七總皂苷粉針組和燈盞花素粉針組，分別靜脈注射復(fù)方粉針8.67 mg·kg-1，三七總皂苷注射液8.33 mg·kg-1，燈盞花素注射液0.33 mg·kg-1。復(fù)方粉針及三七總皂苷粉針組：于給藥前及給藥結(jié)束后2，5，10，15，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，12，24，36，48，72，96，120，168 h采血；燈盞花素粉針組：給藥前及給藥后2，5，10，15，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8 h采血。血樣置于肝素抗凝試管中，采血后立即4 ℃，3000 r·min-1離心10 min(r=17 cm)，取上清液于-80 ℃保存待測。

1.5色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件 Ultimate Polar-C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-20 mmol·L-1乙酸胺溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序詳見表1。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；樣品箱溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

表1 6種組分的洗脫程序 Tab.1 Elution program for six components

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負(fù)離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測；離子源電壓為-4500 V，溫度為600 ℃，監(jiān)測離子對分別為：三七皂苷R1m/z931.60→475.40，人參皂苷Rg1m/z799.50→637.50，人參皂苷Rem/z945.60→475.50，人參皂苷Rb1m/z1107.70→945.60，人參皂苷Rdm/z945.60→621.50，野黃芩苷m/z461.10→285.10，替米沙坦m/z513.30→469.30。

1.6血漿樣品的處理 取血樣0.2 mL，加入亞硫酸氫鈉(1 mol·L-1)和內(nèi)標(biāo)工作液(替米沙坦1.15 μg· mL-1)各30 μL，加入甲醇0.6 mL；渦旋1 min后，15 000 r·min-1離心10 min(r=8.4 cm)，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

1.7標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 對照品溶液的配制：精密稱取各對照品適量，用甲醇溶解定容，制成的儲備液濃度分別為三七皂苷R1239.32 μg· mL-1，人參皂苷Rg1235.16 μg· mL-1，人參皂苷Re 197.49 μg· mL-1，人參皂苷Rb1244.65 μg· mL-1，人參皂苷Rd 1.247 mg· mL-1，野黃芩苷214.59 μg· mL-1。分別取上述6 種成分的對照品儲備液3.34，5.74，1.52，8.17，7.21，4.66 mL，分別用甲醇定容至10 mL，再經(jīng)甲醇系列稀釋7個梯度，得線性范圍項下各對照品溶液濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取替米沙坦對照品(含替米沙坦11.43 mg)11.51 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到228.6 μg· mL-1替米沙坦儲備液，置于-20 ℃冰箱保存。用甲醇將替米沙坦儲備液稀釋至1150 ng· mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液備用。

1.8質(zhì)量控制樣品的配制 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、野黃芩苷的低、中、高濃度質(zhì)量控制溶液各20 μL，混勻后氮氣吹干，加入空白犬血漿200 μL，配制各濃度質(zhì)量控制樣品。各組分質(zhì)量控制樣品的濃度詳見表2。

表2 6種組分的質(zhì)量控制樣品濃度 Tab.2 Concentration of quality control for six components ng· mL-1

2 結(jié)果

2.1特異性 在本實驗條件下，各色譜峰峰形良好，分離完全。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、野黃芩苷和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別約為2.73，3.56，3.54，3.91，4.75，2.21和4.36 min。見圖1。

A.三七皂苷R1；B.人參皂苷Rg1；C.人參皂苷Re；D.人參皂苷Rb1；E.人參皂苷Rd；F.野黃芩苷；G.替米沙坦。圖1 復(fù)方粉針給藥10 min后比格犬血樣色譜圖 A.notoginsenoside R1；B.ginsenoside Rg1；C.ginsenoside Re；D.ginsenoside Rb1；E.ginsenoside Rd；F.scutellarin；G.telmisartan.Fig.1 Chromatogram of plasma sample from Beagles 10 min after the administration of compound injection

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 取三七總皂苷各組分及野黃芩苷各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，混勻后氮氣吹干，加入空白犬血漿200 μL，配制成各濃度模擬血漿樣品，按照“1.6”項下操作，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明血漿中以上6種成分線性關(guān)系良好。各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍及典型線性方程見表3。

表3 6種組分的典型方程和線性范圍 Tab.3 Linear equation and linear range for six components

2.3準(zhǔn)確度、精密度 質(zhì)量控制按照“1.6”項下操作，每一濃度進(jìn)行5份樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算質(zhì)量控制樣品的測得濃度，根據(jù)質(zhì)量控制樣品結(jié)果計算準(zhǔn)確度與精密度。經(jīng)測定3個濃度下三七皂苷R1等6種組分的日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)最大值為10.07%，低、中、高濃度下各檢測成分質(zhì)量控制的準(zhǔn)確度相對誤差(RE)最大值為-8.03%。結(jié)果見表4。

2.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 質(zhì)量控制按照“1.6”項下操作，每一濃度進(jìn)行5份樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積(A1)；于EP管中加入各組分低、中、高濃度質(zhì)量控制溶液20 μL以及內(nèi)標(biāo)溶液(1150 ng· mL-1) 30 μL，混勻后氮氣吹干；同時取5份不同來源空白犬血漿200 μL，除不加質(zhì)量控制溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“1.6”項下操作，然后盡取上清液，加入到前述EP管內(nèi)，取上清液進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積(B1)；取各組分低、中、高濃度質(zhì)量控制溶液各20 μL以及內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，混勻后氮氣吹干，加入純化水200 μL，加入甲醇0.6 mL；渦旋1 min后，15 000 r·min-1離心10 min(r=8.4 cm)，取上清液進(jìn)樣分析。獲得相應(yīng)峰面積(C1)。以A1/B1計算提取回收率，以B1/C1計算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，在低、中、高濃度下，各組分提取回收率穩(wěn)定；血漿基質(zhì)對各組分的測定無影響。結(jié)果見表4。

2.5穩(wěn)定性 考察各組分低、中、高濃度質(zhì)量控制的室溫(室溫放置2 h)，處理后4 ℃放置2 h，凍融(凍融循環(huán)3次)及長期穩(wěn)定性(-80 ℃冷凍下放置54 d)。經(jīng)測定，4種情況下得到的6種組分的峰面積與零時間點的偏差均在15%以內(nèi)，提示實驗條件下血漿樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)果詳見表4。

表4 方法學(xué)驗證結(jié)果 Tab.4 Validation results of the methodology %，n=5

2.6藥動學(xué)結(jié)果 以DAS 2.1.1版軟件計算相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)，復(fù)方粉針組、三七總皂苷粉針組及燈盞花粉針組各組分的相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表5。其中除血漿消除半衰期(t1/2)、濃度-時間曲線下面積(AUC0-∞)外，達(dá)峰時間(tmax)、峰濃度(Cmax)為實測值。復(fù)方粉針組與三七總皂苷粉針組中多種組分Cmax差異有統(tǒng)計學(xué)意義，包括三七皂苷R1(P<0.05)，人參皂苷Rg1(P<0.01)，人參皂苷Re(P<0.01)和人參皂苷Rd(P<0.01)。

表5 復(fù)方粉針、三七總皂苷粉針、燈盞花素粉針各組分的藥動學(xué)參數(shù) Tab.5 Pharmacokinetic parameters of each component in compound injection，notoginseng total saponins for injection and breviscapine for injection

3 討論

筆者建立了檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb、人參皂苷Rd、野黃芩苷在比格犬血漿中濃度的液質(zhì)聯(lián)用方法。該方法專屬性好，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。

實驗結(jié)果表明，二醇型皂苷(人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd)和三醇型皂苷(三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re)在比格犬內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)差異較大：三醇型皂苷的血藥濃度從2 min的峰濃度迅速下降，呈快速的分布及消除特征；二醇型皂苷的血藥濃度下降緩慢，其t1/2遠(yuǎn)大于三醇型皂苷，表明二醇型在血中分布較慢，在體內(nèi)滯留時間長，可能與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的血漿蛋白結(jié)合率較高有關(guān)[5]。野黃芩苷的血藥濃度呈快速下降趨勢，在體內(nèi)快速分布，消除較快，靜脈注射給藥后2 h血漿濃度已低于10 ng· mL-1，表明野黃芩苷在比格犬體內(nèi)滯留時間較短。

復(fù)方粉針與三七總皂苷粉針或燈盞花素粉針單用相比，人參皂苷Rb1和野黃芩苷的峰濃度Cmax未見顯著性差異，但三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的Cmax顯著性升高。三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針及復(fù)方粉針單次給藥的血藥濃度-時間曲線相似，主要藥動學(xué)參數(shù)包括t1/2、AUC0-∞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明兩者聯(lián)合用藥可提高三七總皂苷部分組分的Cmax，但對野黃芩苷的藥動學(xué)沒有明顯影響。

三七總皂苷具有顯著緩解腦缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與降低血清一氧化氮含量[6]、改善腦組織血流供應(yīng)[7]等有關(guān)；燈盞花素注射液對急性缺血再灌注腦損傷亦具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能涉及改善腦血流量和減少腦組織中n6多不飽脂肪酸的含量等[8]。兩者作用機(jī)制上是否會疊加或互補(bǔ)從而引起協(xié)同作用，尚需研究驗證。本研究中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用僅能增加部分組分的Cmax，對AUC0-∞沒有顯著影響，協(xié)同作用是否與Cmax的增加相關(guān)亦需進(jìn)一步考察。

本研究中，在確定比格犬給藥劑量時，根據(jù)三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針的臨床推薦劑量，采用了按體表面積直接轉(zhuǎn)換法、按mg·kg-1折算mg·(m2)-1轉(zhuǎn)換因子計算法、按照每千克體質(zhì)量占體質(zhì)量表面積相對比值計算法、按照人與各種動物以及各種動物之間用藥劑量換算法分別計算給藥劑量，取最大值作為最終實驗用量，以為后期人體試驗研究提供更為安全的數(shù)據(jù)支持。