周陽 王聰 付民 尹星 常歡 邢艷麗 李毅星 高新雅 王晶

南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤科（河南南陽 473000）

食管癌為常見的消化道腫瘤，其發(fā)生與飲食習(xí)慣、遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)。因缺乏可靠的早期診斷方法，食管癌患者初診多為中晚期，預(yù)后較差［1］。目前，一些腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原等開始用于癌癥早期診斷中，但對食管癌的特異度、敏感度不高，無法滿足診斷需求，迫切需要探尋新的分子標(biāo)志物。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，且穩(wěn)定性極強(qiáng)，不但能輔助腫瘤診斷，還可預(yù)測患者預(yù)后［2］。據(jù)報(bào)道［3］，miRNA 往往在惡性腫瘤中表達(dá)異常，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。miR-27a、miR-138-5p 是分別在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常的miRNA，作為腫瘤篩查標(biāo)志物中有一定潛力。MAGHSUDLU 等［4］報(bào)道，miR-27a 在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。WANG 等［5］表明，miR-138-5p 在人類大腸癌中充當(dāng)腫瘤抑制因子。但miR-27a、miR-138-5p 作為食管癌篩查標(biāo)志物的鮮有報(bào)道。故本研究通過熒光定量PCR 法檢測血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平，探討其對食管癌的診斷、術(shù)后生存預(yù)測以及與患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)性，并為食管癌診斷和預(yù)后評估提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 病例資料本研究納入醫(yī)院收治的食管癌患者70 例、慢性食管炎患者230 例、健康體檢者70 例為研究對象，分別設(shè)為食管癌組、食管炎組、健康組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）食管癌組經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為食管癌；食管炎組經(jīng)食管造影、內(nèi)鏡、病理檢查等排除食管癌可能性，確診為慢性食管炎；健康體檢者經(jīng)查體顯示無惡化器質(zhì)性病變，健康狀態(tài)良好。（2）臨床病理資料完整。（3）神智、溝通能力正常，簽訂了知情同意書。（4）主動配合隨訪、復(fù)查。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）食管癌患者非病理初次確診，或術(shù)前接受過免疫治療、抗腫瘤治療等干預(yù)。（2）術(shù)后3 個(gè)月死亡。（3）既往有其他消化道系統(tǒng)疾病。（4）合并嚴(yán)重精神病、酒精或藥物濫用史等。三組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information of three groups of patients

表1 三組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information of three groups of patients

1.2 方法

1.2.1 血清miR-27a、miR-138-5p 檢測在三組研究對象入院當(dāng)天，采集清晨空腹靜脈血3 mL，1 500 r/min 離心15 min，離心半徑6 cm，取上清液，保存在-80 ℃冰箱，標(biāo)本避免反復(fù)凍融、溶血。取血清標(biāo)本，用miRNeasy Mini Kit 試劑盒（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司）提取miRNA，參考說明書進(jìn)行。取2 μL 總RNA，用TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法（QRT-PCR）檢測三組受檢者的血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平。miR-27a、miR-138-5p 及其內(nèi)參U6 引物由吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括1.2 μL 氯化鎂、10×PCR buffer、0.4 μL 脫氧核糖核苷三磷酸、0.5 μL 上下引物、0.4 μL Taq 酶、1 μL 模板cDNA、14 μL 無RNA 酶雙蒸水。PCR 循環(huán)參數(shù)：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，40 個(gè)循環(huán)。用2-△△CT法計(jì)算miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量。

表2 miR-27a、miR-138-5p、U6 引物序列Tab.2 Primer sequences of mir-27a，mir-138-5p and U6

1.2.2 研究方法（1）比較三組受試者血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平差異。（2）隨訪3 年，統(tǒng)計(jì)食管癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況，并分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組、無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，收集兩組患者資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙、飲酒、腫瘤直徑、分化程度、術(shù)后化療、術(shù)后放療、病理分期、手術(shù)根治程度、切緣陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清miR-27a 及miR-138-5p 表達(dá)水平。對上述可能導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素賦值，以其為自變量，以是否發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（否=0，是=1）為因變量，logistic 回歸分析食管癌患者血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。見表3。（3）隨訪3 年，根據(jù)患者術(shù)后生存情況分為存活組、死亡組，比較組間血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平差異。（4）采用ROC 曲線評估血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術(shù)后生存情況的預(yù)測價(jià)值。

表3 Logistic 回歸分析賦值Tab.3 Logistic regression analysis

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用單因素方差分析，兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。等級資料采取秩和檢驗(yàn)。用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線及曲線下面積（Area under Curve，AUC）分析血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平對食管癌的診斷效能及對患者術(shù)后生存情況的預(yù)測作用。單因素及l(fā)ogistic 回歸分析食管癌患者血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組、食管炎組、健康組血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平三組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。食管癌組血清miR-27a mRNA 相對表達(dá)量高于食管炎組、健康組，食管炎組血清miR-27a mRNA 相對表達(dá)量高于健康組（P＜0.05）；食管癌組血清miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量低于食管炎組、健康組，食管炎組血清miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量低于健康組（P＜0.05）。見表4。

表4 三組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of the relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA among the three groups

表4 三組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of the relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA among the three groups

注：與食管癌組比較，*P＜0.05；與食管炎組比較，#P＜0.05

2.2 食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組、無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的病理參數(shù)比較經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組、無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的病理分期、手術(shù)根治程度和血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余病理參數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組、無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的病理參數(shù)比較Tab.5 Comparison of pathological parameters between postoperative recurrence and metastasis group and non recurrence and metastasis group of esophageal cancer 例（%）

2.3 logistic 回歸分析食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素病理分期Ⅱ-Ⅲ期、姑息性切除術(shù)和血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量升高均為影響食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表6。

表6 食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的多因素分析結(jié)果Tab.6 Multivariate analysis of recurrence and metastasis of esophageal cancer

2.4 存活組、死亡組血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平存活組血清miR-27a mRNA 相對表達(dá)量低于死亡組，血清miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量高于死亡組（P＜0.05）。見表7。

表7 存活組、死亡組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量Tab.7 Relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA in survival group and death group

表7 存活組、死亡組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量Tab.7 Relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA in survival group and death group

2.5 血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術(shù)后生存情況的預(yù)測價(jià)值ROC 結(jié)果顯示：血清miR-27a、miR-138-5p 預(yù)測食管癌術(shù)后生存情況的最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為1.42、0.26，單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測食管癌術(shù)后生存情況的AUC 分別為0.773、0.731、0.829。見表8、圖1。

表8 血清miR-27a、miR-138-5p 單獨(dú)及聯(lián)合檢測對食管癌患者術(shù)后生存情況預(yù)測價(jià)值Tab.8 The predictive value of serum mir-27a and mir-138-5p for postoperative survival of patients with esophageal cancer

圖1 血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術(shù)后生存情況預(yù)測作用的ROC 曲線圖Fig.1 ROC curve of serum mir-27a and mir-138-5p in predicting survival of patients with esophageal cancer

3 討論

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，且發(fā)病情況存在地域性差異，部分地域發(fā)生率極高［6］。目前中晚期食管癌仍以手術(shù)結(jié)合放化療為主，治療結(jié)局不理想，但早期食管癌患者預(yù)后相對良好，因此早期診斷、有效防治是目前應(yīng)對食管癌的最優(yōu)選擇［7］。當(dāng)前多種miRNA被作為腫瘤早期診斷、靶向治療的靶點(diǎn)。張兵等［8］報(bào)道m(xù)iRNA 在人類基因組中的比例不高，但能調(diào)控人類30%以上的基因表達(dá)，在人類疾病特別是惡性腫瘤的生物學(xué)行為過程中扮演重要角色。

miRNA 有組織及細(xì)胞特異性、高度保守性、時(shí)序性，決定了其在不同惡性腫瘤中的表達(dá)情況不同［9-11］。miR-27a、miR-138-5p 作為有潛力的分子標(biāo)志物，參與多種腫瘤生長、分化、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程。LI 等［12］認(rèn)為miR-27a是腫瘤中的新型生物標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)。WANG 等［13］研究證明，miR-27a 在食管癌中呈上調(diào)表達(dá)，可通過干擾其表達(dá)水平增強(qiáng)放射敏感性。FRIEDRICH 等［14］認(rèn)為miR-27a-3p可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。GAO 等［15］經(jīng)薈萃分析證明miR-138表達(dá)水平是預(yù)測食管癌的潛在預(yù)后指標(biāo)；ZHENG等［16］研究發(fā)現(xiàn)miR-138的下調(diào)預(yù)示了食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示：從食管癌組到食管炎組、健康組，血清miR-27a 表達(dá)逐漸下調(diào)，miR-138-5p 表達(dá)逐漸上調(diào)，提示食管癌患者血清miR-27a表達(dá)異常上調(diào)、miR-138-5p表達(dá)異常下調(diào)，與上述研究結(jié)果一致，且提示血清miR-27a、miR-138-5p檢測可用于鑒別食管癌。本研究中，病理分期、手術(shù)根治程度、血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達(dá)量均為影響食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立因素，提示除病理分期、手術(shù)根治程度兩項(xiàng)常規(guī)因素外，血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)與食管癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能與miR-27a、miR-138-5p 全程參與食管癌發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。CUI 等［17］表明，miR-27a 不但可用于腫瘤早期診斷中，其表達(dá)水平與腫瘤分級、患者生存時(shí)間相關(guān)；LANCA等［18］報(bào)道，miR-138可作為非肌肉浸潤性膀胱癌患者預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究中，存活組血清miR-27a mRNA相對表達(dá)量低于死亡組，血清miR-138-5p mRNA相對表達(dá)量高于死亡組，提示其表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步繪制ROC曲線提示二者可準(zhǔn)確預(yù)測患者術(shù)后生存情況，且聯(lián)合預(yù)測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度更高。

本研究存在樣本量小、隨訪時(shí)間短等缺陷，未來研究需增加病例數(shù)，延長隨訪時(shí)間，便于全面評估血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響及對生存情況的預(yù)測價(jià)值，為食管癌治療及預(yù)后預(yù)測提供新的方法。

綜上所述，血清miR-27a、miR-138-5p 表達(dá)水平與食管癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為診斷食管癌的輔助手段，還可用于預(yù)測患者術(shù)后生存情況。未來應(yīng)進(jìn)一步排除相關(guān)影響因素，闡述血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。