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        ETAR-C58 多肽生物合成及其對黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲的影響

        2021-12-28 04:47:26張飛飛張夢王中山
        實用醫(yī)學雜志 2021年22期
        關鍵詞:內皮素黑色素瘤多肽

        張飛飛 張夢 王中山

        1徐州醫(yī)科大學麻醉學院,江蘇省麻醉學重點實驗室(江蘇徐州 221004);2徐州市中心醫(yī)院,東南大學附屬醫(yī)院婦產科(江蘇徐州 221009)

        內皮素(endothelin,ET)主要包括三種同分異構體亞型,分別是ET-1、ET-2、ET-3,皮膚中主要表達ET-1[1]。內皮素通過特異性結合其受體(ETR)而發(fā)揮生物學效應,其受體分為兩種亞型即內皮素A 受體(ETAR)和內皮素B 受體(ETBR),兩者都是G 蛋白偶聯(lián)受體。ET 和ETR 構成的內皮素軸在多種腫瘤包括黑色素瘤中有促進腫瘤的作用[2-4]。

        黑色素瘤是一種惡性程度較高的皮膚腫瘤[5],具有發(fā)病年齡早、轉移率高、臨床預后差等特點[6-7],對各種化療藥物敏感性低且易產生耐藥。隨著惡性黑色素瘤的發(fā)病率在世界范圍內呈上升的趨勢[8],迫切需要更有效的治療方法。

        研究表明[9-12],與良性痣相比,ETBR 在黑色素瘤中的表達增加,ETBR 的激活與黑色素瘤的侵襲密切相關,對其進行阻斷可達到一定的治療效果[9,13]。另外β-arrestin1 作為支架蛋白通過ETR 信號轉導在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移等過程中發(fā)揮著重要的作用[14-16]。ET-1 激活ETR 后,吸引β-arrestin1到細胞膜聚集,而β-arrestin1 和ETR 之間的相互作用是通過ETR 的羧基末端識別介導的[17]。選擇性干擾ETBR 和β-arrestin1 的相互作用,就可能阻止β-arrestin1 介導的信號通路。因此,研究和開發(fā)阻斷ETBR 和β-arrestin1 相互作用的藥物,很有可能具有良好的抗黑色素瘤作用。

        在諸多抗腫瘤藥物中,多肽類藥物因其相對分子質量小、無免疫原性、結構簡單、副作用小等優(yōu)點越來越受到人們的重視,尤其是來源于人類自身蛋白的多肽。常規(guī)地采用化學合成法獲得多肽不僅成本較貴,而且合成過程中可能引入一定的毒性,限制了臨床應用范圍。而大腸桿菌表達體系具有蛋白表達量高、易操作、培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢,而且純化的重組蛋白可以大規(guī)模生產,為進一步研究目的蛋白的生物活性奠定了良好的基礎。

        基于此,本研究擬在體外通過大腸桿菌表達體系表達純化獲得ETAR 羧基末端58 個氨基酸的多肽(ETAR-C58)。在黑色素瘤細胞中,該多肽很有可能和ETBR 競爭性地結合β-arrestin1,從而干擾了ET-1/ETBR/β-arrestin1 信號通路的傳導,進而抑制了黑色素瘤的發(fā)展。實驗結果表明,該多肽緩解了β-arrestin1介導的癌細胞遷移,侵襲等功能,為進一步開展對惡性黑色素瘤的科學研究和臨床應用奠定了良好的基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料人源性惡性黑色素瘤A375 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫;大腸桿菌克隆宿主菌DH5α、表達宿主菌BL21(DE3)和表達質粒pWaldo-GFPe 均為本實驗室保存;限制性內切酶、T4 DNA 連接酶購自NEB;Trizol、逆轉錄酶、DNA 聚合酶購自南京諾唯贊;ET-1 購自北京博奧森;DMEM 培養(yǎng)基購自南京凱基;胎牛血清FBS 購自Lonsera;胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)購自Gibco;MatriGel 購自BD;8 微米孔徑Transwell 24 孔板購自CELLTER;鎳柱和分子篩購自GE 公司;GFP 標簽抗體和HRP 標記的羊抗鼠二抗均購自ABclonal;PCR 引物合成及測序由上海生工完成;FX101 細胞破碎儀(上海勵途公司);蛋白純化系統(tǒng)AKTA Pure(GE 公司);全能型成像系統(tǒng)(UVItech);研究級倒置顯微鏡(OLYMPUS 公司);Nanodrop 2000、酶標儀、細胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 ETAR-C58多肽基因的克隆提取人結腸癌HT-29 細胞的總RNA,根據(jù)逆轉錄酶的使用說明進行逆轉錄反應,以獲得的cDNA 為模板,ETARC58F1:5′-CCATCTCGAGATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTATTTTGTGAGCAAGAAATTTAAAA-3′(下劃線處為XhoI 酶切位點,加粗部分為TAT 穿膜肽序列)和ETAR-C58R1:5′-CGTCGGATCCGTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3′(下劃線處為BamHI 酶切位點)為引物進行PCR 擴增,純化后的PCR 產物經XhoI 和BamHI 酶切后克隆至pWaldo-GFPe 的相同位點,經酶切和測序驗證后,獲得重組質粒pWaldo-ETAR-C58。

        1.2.2 ETAR-C58多肽的誘導表達與純化將轉化有重組質粒的BL21(DE3)表達菌株接種于200 mL含30 μg/mL 卡納青霉素的LB 培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng),然后轉接50 mL 菌液至1 000 mL LB 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6,加入0.2 mmol/L 的IPTG,20 ℃誘導表達20 h 后,6 000 g 離心15 min收集菌體,并用80 mL 裂解緩沖液懸?。?0 mmol/L Tris-HCl pH8.0,300 mmol/L NaCl),加入50 μg/mL溶菌酶、200 U DNAase I 和1 mmol/L PMSF 后,采用細胞破碎儀800 MPa 破碎細胞兩次,4 ℃、8 000 r/min離心30 min去除細胞碎片。取上清液自然流過鎳柱,用100 mL 洗滌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,300 mmol/L NaCl,10%甘油和30 mmol/L咪唑)沖洗柱子,用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,300 mmol/L NaCl,10%甘油和300 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白質,收集蛋白質樣品,過分子篩柱子(緩沖液含20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,300 mmol/L NaCl,10%甘油),收集有吸收峰的蛋白質樣品,SDSPAGE 檢測樣品的純度,采用Nanodrop 2 000 測定多肽濃度。

        1.2.3 免疫印跡鑒定誘導表達的融合蛋白通過SDS-PAGE 分離后,通過濕轉的方法轉移到PVDF膜上,隨后將膜用含有5%脫脂奶粉的TBST 室溫孵育2 h,加GFP 標簽抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜,隨后TBST 洗膜3 × 3 min,加入HRP 標記的羊抗鼠二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST 再次洗膜6 × 3 min,加入ECL 發(fā)光液,用UVI-tech 的全能型成像系統(tǒng)進行拍照。

        1.2.4 A375 細胞處理及分組干預將對數(shù)生長期細胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中,在10%FBS+高糖DMEM、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),待細胞生長至融合率接近80%~90%時,進行無血清化處理12 h,胰蛋白酶消化后,用血球板計數(shù)(為保障數(shù)據(jù)的準確性,重復計數(shù)3 次并取其平均值),按如下分組加入等數(shù)量的細胞:對照組,ET-1 組(10 nmol/L),ET-1 組+ETAR-C58 多肽(2 μmol/L)組,其中ETARC58 多肽在ET-1 干預前1 h 加入,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后進行相應指標的檢測。

        1.2.5 TAT-ETAR-C58 融合多肽穿膜進入細胞的效率當接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿的A375 細胞融合率接近80%~90%時,加入2 μmol/L 純化的多肽,并于細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h,PBS 洗滌后更換新鮮的完全培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng),通過熒光顯微鏡觀察TATETAR-C58 融合多肽穿過細胞膜進入細胞的效率。

        1.2.6 A375 細胞的遷移根據(jù)1.2.4 所述進行細胞的處理后,向24 孔板Transwell 上室加入用無血清DMEM 懸浮的細胞懸浮液2 × 104個細胞,用DMEM 補充至200 μL,下室加600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基。24 h 后移除上、下室的液體,下室加入600 μL 4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min。移除多聚甲醛,PBS 洗滌后,下室加入600 μL 0.5%結晶紫(PBS 配制)染色15 min。再用PBS 洗滌3 次,用棉棒將上室內壁和外壁殘留的結晶紫擦除,切勿碰到膜的表面。將洗滌好的上室轉移到新的24孔里,在顯微鏡下觀察細胞并拍照。最后用20%乙酸進行洗脫,酶標儀OD600檢測。

        1.2.7 A375 細胞的侵襲用無血清的冷DMEM 按照1∶7 稀釋Matrigel,取50 μL Matrigel 稀釋液加到24 孔板Transwell 上室中,37 ℃培養(yǎng)箱里風干0.5 h。根據(jù)1.2.4 所述進行細胞的處理后,向24 孔板Transwell 上室加入用無血清DMEM 懸浮的細胞懸浮液5×104個細胞,用DMEM 補充至200 μL,下室加600 μL 含10%FBS 的培養(yǎng)基,接下來的步驟和遷移實驗相同。

        1.2.8 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以()形式表示,采用Graphpad Prism 軟件進行分析處理,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 ETAR-C58 多肽基因的克隆按照1.2.1 所述的克隆步驟,通過限制性內切酶XhoI 和BamHI 鑒定獲得重組子pWaldo-ETAR-C58,并送往上海生工公司測序。峰圖整齊有序,ETAR-C58 多肽序列正確,共174 bp,編碼形成6.8 kDa 的多肽,和TAT 穿膜肽(1.6 kDa)、GFP 標簽(26 kDa)、TEV 酶切位點(0.9 kDa)融合后其相對分子質量約為35.3 kDa。見圖1。

        圖1 ETAR-C58 多肽表達載體測序峰圖Fig.1 Sequencing of ETAR-C58 peptide expression vector

        2.2 ETAR-C58 多肽的誘導表達、純化與鑒定將pWaldo-ETAR-C58 轉化到E.coli BL21(DE3),經IPTG 誘導表達和SDS-PAGE 分析,融合蛋白得到很好的表達,大小與預期完全一致,且可溶性融合多肽的表達量約為總蛋白的90%。融合多肽經鎳柱和分子篩純化后,SDS-PAGE 檢測純度較高(>95%),見圖2A。免疫印跡結果表明,融合多肽可與GFP 抗體發(fā)生特異性結合,在相應位置有明顯的條帶,說明純化獲得的融合蛋白就是需要的目的多肽,見圖2B。

        圖2 融合多肽TAT-ETAR-C58 的表達純化及免疫印跡分析Fig.2 Expression,purification and western blotting analysis of fusion peptide

        2.3 TAT-ETAR-C58融合多肽穿膜進入細胞的效率TAT 穿膜肽可以作為載體攜帶多肽或蛋白質片段,以非受體依賴的方式穿過細胞膜進入細胞。為了檢測TAT-ETAR-C58融合蛋白穿膜進入細胞的效率,2 μmol/L 多肽和A375 細胞孵育6 h,顯微鏡整個視野下幾乎所有的細胞均呈綠色,即TAT穿膜肽介導的融合蛋白進入細胞的效率較高。見圖3。

        圖3 顯微鏡觀察TAT-ETAR-C58 融合多肽的穿膜效率Fig.3 Transmembrane efficiency of fusion peptide identified by microscope

        2.4 ETAR-C58 多肽對A375 細胞遷移和侵襲的影響根據(jù)1.2.4 所述的方法將處理的A375 細胞分為三組:對照組(Control)、ET-1 組、ET-1+ETARC58 多肽組,ET-1 組中添加10 nmol/LET-1,可以激活黑色素瘤細胞里ET-1/ETBR 組成的內皮素信號軸,ET-1+ETAR-C58 多肽組中提前添加2 μmol/L多肽,以期多肽干擾ET-1/ETBR/β-arrestin1 組成的信號通路,從而阻斷ET-1 所引起的細胞效應。然后按照1.2.6 和1.2.7 所述的方法進行Transwell 遷移和侵襲實驗,結果表明ET-1 組較對照組,轉移和侵襲的細胞數(shù)明顯增加,這與已報道文獻的結果一致[18];ET-1+ETAR-C58 多肽組可以部分阻斷ET-1 組引起的細胞遷移和侵襲效應,即ETAR-C58多肽可以降低A375 細胞的遷移和侵襲能力,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

        圖4 ET-1 和ETAR-C58 多肽對A375 細胞遷移與侵襲能力的影響Fig.4 The effects of ET-1 and ETAR-C58 peptide on migration and invasion of A375 cells by Transwell

        3 討論

        TAT 穿膜肽是人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)來源的參與病毒復制的反式轉錄激活蛋白,作為經典的細胞穿膜肽被廣泛用于各種物質的胞內轉運[19-21]。本研究結果表明大多數(shù)細胞都具有綠色熒光,即大多數(shù)TAT-ETAR-C58-GFP 融合蛋白可以進入細胞內發(fā)揮生物學功能,說明TAT 穿膜肽作為一種藥物運輸載體具有較大的潛力。

        為了提高目的融合肽的表達量和克服小肽易被蛋白酶所降解的缺點,本研究選擇以綠色熒光蛋白(GFP)作為融合標簽,另外GFP 作為一種可以發(fā)出很強熒光的蛋白分子,可以很好地定位和追蹤目的蛋白。為了防止GFP 標簽影響多肽的活性,本研究在多肽和GFP 之間添加了TEV 蛋白酶的酶切位點,方便下一步獲得沒有標簽的多肽。β-arrestin1 可作為GPCRs 信號的轉換器,參與多種信號傳導途徑,引起細胞增殖、凋亡、組織的炎癥反應及血管新生等生物學效應[22-23]。上述生物學效應與多種腫瘤的增殖、遷移、惡化、轉移密切相關。β-arrestin1 作為癌癥發(fā)生、發(fā)展的關鍵分子,靶向β-arrestin1 的藥物研究將蘊含巨大的臨床治療潛力。有研究表明[18],ET-1/ETBR/β-arrestin1 信號軸參與調節(jié)了黑色素瘤細胞的遷移和血管生成擬態(tài)。ZHANG 等[24]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中主要表達截短的ETAR(缺少了外顯子3 和4),而且該ETAR對ET-1 的親和力較低。所以在黑色素瘤細胞中,主要是ET-1 和ETBR 組成的內皮素軸發(fā)揮作用,而且β-arrestin1 可以和ETR 羧基末端結合進而介導了信號通路的傳導[17],根據(jù)這些特點,本研究創(chuàng)新性設計的ETAR-C58 多肽,可能通過干擾ETBR和β-arrestin1 之間的相互作用,進而影響了該信號通路的傳導,而實驗結果表明,ETAR-C58 多肽抑制了A375 細胞的侵襲和轉移。說明ETAR-C58 多肽可以干擾β-arrestin1 和ETBR 兩者的相互作用,進而抑制腫瘤的發(fā)展。

        本研究目前只是在體外水平,初步驗證了ETAR-C58 多肽具有抗腫瘤的作用,下一步將采用TEV 酶切掉GFP 標簽后,獲得分子量更小的活性ETAR-C58 小肽,通過進行小鼠體內實驗,進一步驗證其抗腫瘤活性,并對其作用機制做進一步研究,以期開發(fā)出一種新型、高效、低毒,具有良好臨床應用前景的治療黑色素瘤的藥物。

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