王燚偉，田永利，馬廣恩，張永占

(秦皇島市第一醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，河北 秦皇島 066001)

骨關(guān)節(jié)炎是中老年人常見的慢性退行性關(guān)節(jié)病變，病因復(fù)雜且發(fā)病機(jī)制未完全闡明，至今仍缺乏特效的治療手段。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用，表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞外基質(zhì)合成及分解紊亂。近些年，微小RNA(microRNA，miR)在軟骨細(xì)胞損傷中的作用受到越來越多關(guān)注，不同的miRs可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等環(huán)節(jié)在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中引起軟骨細(xì)胞損傷[1-3]。國內(nèi)殷春明等[4]的一項(xiàng)臨床研究證實(shí)，骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中miR-140-3p的表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)，且關(guān)節(jié)病變?cè)街豰iR-140-3p表達(dá)越低；Wang等[5]的研究在椎間盤退行性改變中證實(shí)miR-140-3p具有保護(hù)作用?；诖颂岢黾僭O(shè)，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中miR-140-3p起軟骨細(xì)胞保護(hù)作用，其表達(dá)降低會(huì)削弱保護(hù)作用并引起或加重軟骨細(xì)胞損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究以白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型為對(duì)象，通過細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)分析了miR-140-3p的生物學(xué)作用及機(jī)制，旨在為闡明miR-140-3p在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞株ATDC5(中科院上海細(xì)胞資源中心，中國)。

1.2 試劑 IL-1β(Sigma公司，美國)；miR-140-3p及陰性對(duì)照(NC)miR、陰性對(duì)照腺病毒(Ad-NC)及過表達(dá)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associatal X protein，BAX)的腺病毒(Ad-BAX)(上海吉?jiǎng)P公司，中國)；miR提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)試劑盒(北京天根生化公司，中國)；四唑化合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]法細(xì)胞存活檢測(cè)試劑盒(Biovision公司，美國)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal dexynucleotidyl transferase dutp nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(上海翌圣生物公司，中國)；細(xì)胞裂解液(上海碧云天公司，中國)；BAX、裂解型Caspase-3(Cleaved caspase-3)(Abcam公司，美國)；雙熒光素酶報(bào)告基因及檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司，丹麥)。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)；顯微鏡(Nikon公司)；電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 ATDC5細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行消化傳代。傳代的細(xì)胞接種在不同規(guī)格的培養(yǎng)板內(nèi)并進(jìn)行分組干預(yù)。細(xì)胞的分組干預(yù)共分入三部分，具體如下。第一部分：驗(yàn)證IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷模型中miR-140、BAX表達(dá)的變化，細(xì)胞分為不同劑量IL-1β組，分別用含有0、1、5、10 ng/mL IL-1β的培養(yǎng)基處理。第二部分：驗(yàn)證miR-140在IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷模型中的生物學(xué)作用，細(xì)胞分為miR-NC組、miR-NC+IL-1β組、miR-140+IL-1β組。miR-NC組轉(zhuǎn)染NC miR，miR-NC+IL-1β組轉(zhuǎn)染NC miR并加入IL-1β使其終濃度達(dá)到10 ng/mL，miR-140+IL-1β組轉(zhuǎn)染miR-140-3p并加入IL-1β使其終濃度達(dá)到10 ng/mL。第三部分：驗(yàn)證BAX在miR-140減輕在IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷中的作用，細(xì)胞分為miR-NC+Ad-NC組、miR-NC+Ad-NC+IL-1β組、miR-140+Ad-NC+IL-1β組、miR-140+Ad-BAX+IL-1β組，在IL-1β處理、轉(zhuǎn)染NCmiR或miR-140-3p的基礎(chǔ)上感染NC腺病毒或BAX腺病毒。

1.5 miR-140-3p表達(dá)的檢測(cè) ATDC5細(xì)胞分組干預(yù)24 h時(shí)采用試劑盒進(jìn)行細(xì)胞中miR的提取，將miR反轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的cDNA，使用miR-140-3p或U6的引物配置PCR反應(yīng)體系，在PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min后95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s，并重復(fù)40個(gè)循環(huán)，得到PCR反應(yīng)的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-140的表達(dá)水平。

1.6 BAX、Cleaved caspase-3表達(dá)的檢測(cè) ATDC5細(xì)胞分組干預(yù)24 h時(shí)采用裂解液提取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，將含有30 μg蛋白的樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行western blot檢測(cè)，先進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h，用1︰1 000稀釋的BAX、Cleaved caspase-3抗體或1︰5 000稀釋的β-actin抗體在4 ℃孵育PVDF膜過夜。第2天用1︰2 000稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗在室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞存活率的檢測(cè) ATDC5細(xì)胞分組干預(yù)24 h時(shí)采用MTS法進(jìn)行細(xì)胞存活率的檢測(cè)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作并在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長的吸光值，按照[(實(shí)驗(yàn)孔吸光值-空白孔吸光值)/(對(duì)照孔吸光值-空白孔吸光值)×100%]計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) ATDC5細(xì)胞分組干預(yù)24 h時(shí)采用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色操作后在顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)高倍視野，對(duì)TUNEL陽性染色細(xì)胞、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)陽性染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，而后按照[(TUNEL陽性染色細(xì)胞/DAPI陽性染色細(xì)胞)×100%]計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.9 生物信息學(xué)分析 在Targetscan數(shù)據(jù)庫(http：//www.targetscan.org)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，輸入miR-140-3p，分析BAX中與miR-140-3p互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 首先構(gòu)建含有野生型BAX基因3’UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因，根據(jù)Targetscan網(wǎng)站中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果，將3’UTR中與miR-140-3p互補(bǔ)配對(duì)的堿基進(jìn)行突變，得到突變型BAX雙熒光素酶報(bào)告基因。將野生型或突變型報(bào)告基因與miR-140-3p或NC miR共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入ATDC5細(xì)胞，48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲及海腎的熒光活力，計(jì)算螢火蟲與海腎熒光活力的比值作為雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力。

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷模型中miR-140-3p、BAX表達(dá)的變化 與0 ng/mL IL-1β組比較，1 ng/mL IL-1β、5 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β組ATDC5細(xì)胞中miR-140-3p的表達(dá)水平均明顯降低，BAX的表達(dá)水平明顯增加，且隨著IL-1β濃度的增加ATDC5細(xì)胞中miR-140-3p的表達(dá)水平逐漸降低，BAX的表達(dá)水平增加(P<0.05，見圖1)。

a miR-140-3p表達(dá)比較 b BAX表達(dá)比較

2.2 miR-140-3p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷模型存活率及凋亡率的影響 采用熒光定量PCR檢測(cè)miR-140-3p的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2a所示：與miR-NC組比較，miR-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中miR-140-3p的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與miR-NC+IL-1β組比較，miR-140+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中miR-140-3p的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。

采用MTS法檢測(cè)存活率、TUNEL法檢測(cè)凋亡率，結(jié)果見圖2b～d：與miR-NC組比較，miR-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞的存活率明顯降低、凋亡率明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+IL-1β組比較，miR-140+IL-1β組ATDC5細(xì)胞的存活率明顯增加、凋亡率明顯降低(P<0.05)。

a miR-140-3p表達(dá)水平比較

2.3 miR-140-3p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷模型中BAX、Cleaved caspase-3表達(dá)的影響 采用Western blot檢測(cè)BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)，結(jié)果見圖3所示：與miR-NC組比較，miR-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+IL-1β組比較，miR-140+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

a BAX表達(dá)水平比較 b Cleaved caspase-3表達(dá)水平比較

2.4 miR-140-3p靶向調(diào)控ATDC5細(xì)胞中BAX的表達(dá) 在Targetscan網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果見圖4a所示：BAX基因mRNA 3’UTR中含有miR-140-3p的結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果見圖4b～c所示：與miR-NC組比較，miR-140-3p組ATDC5細(xì)胞中野生型BAX雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力明顯降低(P<0.05)，突變型BAX雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力無明顯變化(P>0.05)。

a miR-140-3p靶向調(diào)節(jié)BAX的生物信息學(xué)分析

2.5 過表達(dá)BAX對(duì)miR-140-3p減輕IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞損傷的影響 采用Western blot檢測(cè)BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)，結(jié)果見圖5a～b所示：與miR-NC+Ad-NC組比較，miR-NC+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與miR-140+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-BAX+IL-1β組ATDC5細(xì)胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。

a 細(xì)胞BAX表達(dá)水平比較 b 細(xì)胞Cleaved caspase-3表達(dá)水平比較

采用MTS法檢測(cè)存活率、TUNEL法檢測(cè)凋亡率，結(jié)果如圖2c～e所示：與miR-NC+Ad-NC組比較，miR-NC+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞的存活率明顯降低、凋亡率明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細(xì)胞的存活率明顯增加、凋亡率明顯降低(P<0.05)；與miR-140+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-BAX+IL-1β組ATDC5細(xì)胞的存活率明顯降低、凋亡率明顯增加(P<0.05)。

3 討 論

軟骨細(xì)胞損傷在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用受到越來越多的關(guān)注，在軟骨細(xì)胞發(fā)生損傷的過程中，細(xì)胞數(shù)量不斷減少、細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)水解，最終導(dǎo)致軟骨彈性下降及骨贅形成[6-8]。目前，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中軟骨細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，國內(nèi)外兩項(xiàng)臨床研究均證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中miR-140-3p表達(dá)降低與病情加重有關(guān)[4，9]，另有miR-140-3p相關(guān)的基礎(chǔ)研究證實(shí)該miR對(duì)椎間盤的退行性改變具有保護(hù)作用[5]。以上國內(nèi)外的研究結(jié)果提示具有保護(hù)作用的miR-140-3p表達(dá)降低與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)，本文將以miR-140-3p為切入點(diǎn)研究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。

IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型是目前研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制常用的細(xì)胞模型，軟骨細(xì)胞在IL-1β的刺激下會(huì)出現(xiàn)存活率降低、凋亡率增加的損傷表現(xiàn)[9-10]。本研究在細(xì)胞模型中檢測(cè)到miR-140-3p的表達(dá)水平明顯降低，與相關(guān)臨床研究中miR-140-3p表達(dá)降低的結(jié)果一致。在IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型中，本研究也檢測(cè)到細(xì)胞存活率降低、凋亡率增加，與既往骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型相關(guān)的研究結(jié)果[10-11]一致。為了探究miR-140-3p在IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷中的作用，本研究在IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的過程中轉(zhuǎn)染miR-140-3p使其表達(dá)增加，分析結(jié)果顯示過表達(dá)miR-140-3p使細(xì)胞的存活率增加、凋亡率降低，表明miR-140-3p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

BAX是體內(nèi)重要的凋亡基因，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中軟骨細(xì)胞凋亡與BAX的高表達(dá)有關(guān)。多項(xiàng)臨床和基礎(chǔ)研究均證實(shí)，骨關(guān)節(jié)炎患者及動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨中BAX的表達(dá)明顯增加[12-14]。本研究在IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型中BAX的表達(dá)水平增加，與既往臨床和基礎(chǔ)研究的結(jié)果吻合。BAX參與線粒體途徑凋亡的調(diào)控，通過增加線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加Cleaved caspase-3的表達(dá)并引起細(xì)胞凋亡[15-16]。過表達(dá)miR-140-3p后，IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型中BAX、Cleaved caspase-3的表達(dá)降低，與miR-140-3p抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的作用吻合，也提示miR-140-3p抑制凋亡的作用可能與抑制BAX所介導(dǎo)的線粒體途徑凋亡有關(guān)。

miRs對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用通過識(shí)別并結(jié)合3’UTR、促進(jìn)mRNA降解或阻礙mRNA的翻譯來實(shí)現(xiàn)。本研究在Targetscan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了在線生物信息學(xué)分析，BAX基因3’UTR中含有miR-140-3p互補(bǔ)配對(duì)的堿基；利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，miR-140-3p使BAX野生型報(bào)告基因的熒光活力降低，將報(bào)告基因中miR-140-3p互補(bǔ)配對(duì)的堿基突變后，miR-140-3p不再影響報(bào)告基因的熒光活力，由此證實(shí)miR-140-3p靶向BAX基因的3’UTR。在此基礎(chǔ)上本研究還通過感染腺病毒、過表達(dá)BAX的方式驗(yàn)證了BAX在miR-140-3p減輕IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷中的作用，結(jié)果顯示：過表達(dá)BAX后miR-140-3p使IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型存活率增加及凋亡率、Cleaved caspase-3表達(dá)降低的作用明顯減弱，表明miR-140-3p的保護(hù)作用與靶向抑制BAX有關(guān)。

綜上所述，miR-140-3p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型具有保護(hù)作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡并靶向抑制凋亡基因BAX的表達(dá)，抑制BAX介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是miR-140-3p發(fā)揮上述保護(hù)作用的相關(guān)分子機(jī)制。這為今后研究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制、骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中軟骨細(xì)胞損傷的分子機(jī)制提供了新思路和新靶點(diǎn)。