王 芳，沈舒雨，楊 柳，林妍敏，南雄雄，張俊華

（1.寧夏大學(xué)地理科學(xué)與規(guī)劃學(xué)院，銀川750021；2.教育部中阿旱區(qū)特色資源與環(huán)境治理國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，銀川750021；3.寧夏林業(yè)研究院股份有限公司，銀川750004；4.國(guó)家林業(yè)和草原局枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川750004；5.寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，銀川750021）

0 引 言

土壤有機(jī)碳（SOC）是全球碳循環(huán)中最重要的碳庫(kù)之一。采用合理的農(nóng)業(yè)管理措施，可使全球農(nóng)業(yè)土壤碳庫(kù)提高約0.4～0.9 Pg/a，50年可累積增加24～43 Pg C[1]。根據(jù)功能、周轉(zhuǎn)時(shí)間以及化學(xué)屬性的不同，土壤有機(jī)碳庫(kù)可分為活性庫(kù)、慢性庫(kù)和惰性庫(kù)，而土壤碳庫(kù)的動(dòng)態(tài)變化主要體現(xiàn)在土壤活性碳庫(kù)中[2]。盡管活性有機(jī)碳只占土壤有機(jī)碳總量的一小部分，但能夠在土壤全碳變化之前反映出土壤微小的變化。作為對(duì)外界環(huán)境變化響應(yīng)更敏感的指標(biāo)，它不僅能對(duì)耕作、施肥措施做出快速響應(yīng)，而且在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化方面也發(fā)揮著重要作用[3,4]。土壤活性有機(jī)碳通常用易氧化有機(jī)碳（EOC）、水溶性有機(jī)碳（DOC）、微生物量碳（MBC）等指標(biāo)來(lái)表征[5]。

枸杞是寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物，枸杞產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的主要來(lái)源之一。葉用枸杞是我國(guó)特有的“藥食同源”綠色木本蔬菜，其生育期內(nèi)養(yǎng)分需求規(guī)律、栽培技術(shù)等方面均與傳統(tǒng)枸杞存在很大差別[6,7]。目前葉用枸杞的施肥量大多也是根據(jù)傳統(tǒng)果用枸杞及其他草本葉菜種植經(jīng)驗(yàn)得出的施肥量，差異較大，且大部分地區(qū)采用粗放的施肥管理模式，施肥時(shí)機(jī)、種類(lèi)、數(shù)量均不能與葉用枸杞的養(yǎng)分需求相匹配。寧夏是中國(guó)水資源最少的省區(qū)，降雨量、地表水和地下水量都十分貧乏，而葉用枸杞生育期內(nèi)農(nóng)戶(hù)常用灌水量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其本身生長(zhǎng)所需，造成不必要的水資源浪費(fèi)。不合理的水肥管理方式不但引起嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，同時(shí)也加劇了環(huán)境污染[8]。因此尋求經(jīng)濟(jì)有效的土壤養(yǎng)分管理措施，改善產(chǎn)區(qū)土壤質(zhì)量，提高土壤肥力和作物生產(chǎn)力，是旱區(qū)葉用枸杞產(chǎn)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)亟待解決的問(wèn)題。滴灌水肥一體化技術(shù)是一種灌溉與施肥融為一體的農(nóng)業(yè)新技術(shù)，可顯著地提高灌溉、施肥效率，提高作物產(chǎn)量品質(zhì)，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。因此，成為實(shí)施范圍較廣的一種重要的農(nóng)田管理措施[9]。研究發(fā)現(xiàn)，滴灌施肥對(duì)提高土壤活性有機(jī)碳有積極的作用，會(huì)影響土壤水分分布和碳循環(huán)[1,10]。與常規(guī)施肥相比，滴灌一體化增加了番茄產(chǎn)量，提高了氮肥利用率[11]。目前滴灌水肥一體化技術(shù)也逐漸應(yīng)用在枸杞栽培種植上[12]，根據(jù)當(dāng)?shù)赝寥捞攸c(diǎn)和枸杞需肥規(guī)律選擇適宜適量的水肥用量是提高肥料利用率和產(chǎn)量的關(guān)鍵，施肥方式的重大轉(zhuǎn)變，該地區(qū)葉用枸杞種植土壤活性有機(jī)碳庫(kù)將如何響應(yīng)？目前關(guān)于葉用枸杞科學(xué)水肥管理措施方面的研究不足，可查閱的文獻(xiàn)資料大多也是根據(jù)傳統(tǒng)果用枸杞種植或其他草本葉菜種植經(jīng)驗(yàn)獲得的施肥量，且施肥量差異較大。

土壤微生物是土壤養(yǎng)分生物地球化學(xué)循環(huán)和發(fā)揮生態(tài)系統(tǒng)功能的驅(qū)動(dòng)者和重要載體[13]，土壤微生物組在氮磷養(yǎng)分遷移轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵土壤過(guò)程中發(fā)揮了決定性的作用[14]，也是維系陸地生態(tài)系統(tǒng)中植物地上-地下相互作用的紐帶[15]。土壤微生物生物量和群落組成變化驅(qū)動(dòng)著土壤氮磷的轉(zhuǎn)化，為植物高效利用肥料和生態(tài)平衡提供基礎(chǔ)，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能和穩(wěn)定性的敏感指標(biāo)[16]。研究表明，不同施肥和土地利用方式可通過(guò)改變土壤的微環(huán)境直接或間接影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、組成及其功能，并且受土壤pH、質(zhì)地、水分、有機(jī)碳含量、養(yǎng)分有效性等因子的驅(qū)動(dòng)[17,18]。因此充分了解不同農(nóng)田管理措施下土壤微生物調(diào)控養(yǎng)分有效性的影響機(jī)制，對(duì)于實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、養(yǎng)分高效利用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前關(guān)于葉用枸杞科學(xué)施肥管理措施方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，且有關(guān)滴灌條件下不同養(yǎng)分組合對(duì)葉用枸杞種植土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化影響方面的研究尚未見(jiàn)到報(bào)道。鑒于此，本文通過(guò)田間定位試驗(yàn)，以葉用枸杞園土壤為研究對(duì)象，分析滴灌條件下不同養(yǎng)分組合對(duì)葉用枸杞種植土壤肥力和微生物群落特征的影響，為旱區(qū)特色作物養(yǎng)分高效利用和資源可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

田間定位試驗(yàn)在國(guó)家林業(yè)局枸杞工程技術(shù)研究中心的枸杞示范基地（35°25′ N，106°10′ E）進(jìn)行，海拔約1 110 m，試驗(yàn)區(qū)地處西北內(nèi)陸，屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，晝夜溫差大，年平均降水量180 mm 左右，年蒸發(fā)量1 883 mm 左右，相對(duì)濕度45%～60%，年平均氣溫8.5 ℃，雨雪稀少，蒸發(fā)強(qiáng)烈，冬春干旱，四季多風(fēng)。全年無(wú)霜期160～170 d，年平均日照時(shí)間2 800～3 000 h，土壤類(lèi)型為風(fēng)沙土。2017年3月開(kāi)始田間試驗(yàn)。試驗(yàn)前0～20 cm 土壤的化學(xué)性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)4.83 g/kg，全氮0.41 g/kg，全磷0.56 g/kg，速效氮45 mg/kg，速效磷13.2 mg/kg，速效鉀66 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在枸杞傳統(tǒng)養(yǎng)分施入量的基礎(chǔ)上，針對(duì)葉用枸杞養(yǎng)分?jǐn)y出比例，對(duì)氮磷質(zhì)量濃度進(jìn)行調(diào)整，將氮素質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)水平，分別為40（N1）、60（N2）、80（N3）mg/L；磷素質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)水平，分別為10（P1）、20（P2）、30（P3）mg/L；鉀素質(zhì)量濃度統(tǒng)一設(shè)置為40 mg/L，將人工撒施肥料設(shè)為對(duì)照（CK，月中旬施肥一次，全年施肥四次，N、P、K 純養(yǎng)分施肥量達(dá)到1 402.5、292.5和132 kg/hm2）。試驗(yàn)共設(shè)10個(gè)處理，分別為：N1P1（N 40 mg/L，P 10 mg/L）；N1P2（N 40 mg/L，P 20 mg/L）；N1P3（N 40 mg/L，P 30 mg/L）；N2P1（N 60 mg/L，P 10 mg/L）；N2P2（N 60 mg/L，P 20 mg/L）；N2P3（N 60 mg/L，P 30 mg/L）；N3P1（N 80 mg/L，P 10 mg/L）；N3P2（N 80 mg/L，P 20 mg/L）；N3P3 （N 80 mg/L，P 30 mg/L）；CK，每個(gè)處理重復(fù)3 次，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為35 m2（10 m×3.5 m）。每小區(qū)種植5 行枸杞，株行距70 cm×20 cm，種植密度7 萬(wàn)株/hm2。

試驗(yàn)期間每個(gè)小區(qū)采用滴灌，灌水時(shí)間、灌水量均一致，灌水時(shí)間從3月底土層解凍后開(kāi)始，至11月土壤封凍前結(jié)束，共計(jì)灌水7 500 m3/hm2。N、P、K 肥按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度配置成肥液，全生育期通過(guò)比例施肥器隨水施入。供試肥料為尿素（含N 量46%）、磷酸二氫鉀（含K2O 量34%、含P2O5量52%）、硝酸鉀（含K2O 量46%、含N 量14%）。施肥裝置由水源、水表、液壓比例施肥泵、滴灌管、輸配水管等組成。比例施肥泵的進(jìn)出口直徑為25 mm，流量為20～2 500 L/h，水壓為0.02～0.3 MPa。內(nèi)置滴灌管直徑為16 mm，壁厚為0.20 mm，工作壓力為50～100 kPa，滴管間距為0.30 m，額定流量為2.0 L/h。在整個(gè)生長(zhǎng)季，肥料按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度配置成肥液，通過(guò)比例施肥器隨水施入。各處理鋤草、修剪等田間管理均保持一致。供試作物為枸杞“寧杞9 號(hào)”（6年生），是國(guó)家林業(yè)局枸杞工程技術(shù)研究中心采用倍性育種方法選育出的三倍體葉用枸杞新品種，該品種具有生長(zhǎng)量大、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、栽培性能好、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，其植株葉芽鮮嫩、風(fēng)味良好、營(yíng)養(yǎng)豐富，適于枸杞芽菜、芽茶的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)與利用。

1.3 樣品采集與測(cè)定方法

2019年枸杞收獲后采集0～20 cm耕層土壤樣品，各小區(qū)按照S 形5 點(diǎn)采樣。剔除雜物后混合制樣，過(guò)2 mm 篩，部分樣品風(fēng)干后分別過(guò)1 mm和0.15 mm，于4 ℃冰箱內(nèi)保存，用于理化測(cè)試與微生物分析。

土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]。土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀稀釋熱法；土壤水溶性有機(jī)碳采用水浸提法(水土比2∶1)測(cè)定，土壤易氧化有機(jī)碳采用0.02 M 高錳酸鉀氧化法測(cè)定，土壤硝態(tài)氮采用紫外分光光度法，土壤微生物碳采用熏蒸提取法。

土壤微生物群落總DNA 采用E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek， Norcross，GA， U.S.)進(jìn)行抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測(cè)定DNA 濃度和純度。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus ?Fluorometer（Promega，USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫(kù)：接頭鏈接；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；磁珠回收PCR 產(chǎn)物得到最終的文庫(kù)。利用Illumina 公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根際土壤微生物高通量測(cè)序數(shù)據(jù)利用Miseq PE300 平臺(tái)分析。具體如下：①物種注釋與評(píng)估：利用Uparse（vsesion 7.1http：//drive5.com/uparse/），對(duì)97%相似水平下的群落聚類(lèi)（OTU）進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)mothur 指數(shù)分析計(jì)算α 多樣性指數(shù)；②物種組成分析：基于tax_summary_a 文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R 語(yǔ)言工具作圖；③樣本比較分析：PCoA（Principal co-ordinates analysis） 即主坐標(biāo)分析利用R 語(yǔ)言PCoA 統(tǒng)計(jì)分析和作圖；④環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析：RDA 利用R 語(yǔ)言Vegan 包中RDA 分析和作圖。相關(guān)性Heatmap 分析利用軟件R（heatmap package）作圖。⑤Network 網(wǎng)絡(luò)分析：?jiǎn)?雙因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析利用軟件Networkx 進(jìn)行分析作圖。數(shù)據(jù)利用Excel 2010分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)分組合對(duì)葉用枸杞產(chǎn)量及土壤活性有機(jī)碳庫(kù)的影響

不同養(yǎng)分組合對(duì)葉用枸杞產(chǎn)量及土壤活性有機(jī)碳庫(kù)的影響如表1所示。添加氮肥、磷肥用量對(duì)葉用枸杞的產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.01），而氮磷的交互作用對(duì)枸杞產(chǎn)量無(wú)顯著影響。中、低氮肥用量下，當(dāng)磷肥用量為30 mg/L 時(shí)，處理間差異顯著；中、低磷肥用量下，當(dāng)?shù)视昧繛?0 mg/L 時(shí)，處理間差異顯著。10 個(gè)處理中，以N2P3 處理的枸杞產(chǎn)量最高，N3P3處理次之，分別較對(duì)照顯著提高43.0%和35.9%。

表1 不同養(yǎng)分組合對(duì)葉用枸杞產(chǎn)量及土壤活性有機(jī)碳庫(kù)的影響Tab.1 Effects of different nutrient combinations on yield of lycium barbarum L and soil active organic carbon pool

與對(duì)照（CK）相比，滴灌條件下不同養(yǎng)分配施處理顯著增加土壤有機(jī)碳、水溶性有機(jī)碳、易氧化有機(jī)碳、微生物量碳和硝態(tài)氮含量（P＜0.05）。土壤有機(jī)碳含量增幅為33.6%～144.4%，中等氮肥用量下（60 mg/L），土壤有機(jī)碳含量總體呈現(xiàn)出隨磷肥用量的增加而增加的趨勢(shì)，且處理間差異顯著(P＜0.05)；中、高磷肥用量下（20 mg/L 和30 mg/L），土壤SOC 含量隨著氮肥的增加而顯著增加。所有施肥處理中以N3P3 處理的土壤SOC 含量最大，達(dá)到6.77 g/kg，較對(duì)照顯著提高144.4%。中等氮肥用量下，水溶性有機(jī)碳隨磷肥用量的增加而顯著增加。在高氮肥用量下（80 mg/L），水溶性有機(jī)碳隨施磷水平的增加而顯著降低，但3個(gè)處理仍顯著高于對(duì)照。同一氮肥用量下，土壤易氧化有機(jī)碳含量總體表現(xiàn)出隨磷肥用量的增加而逐漸降低的趨勢(shì)，除N1P3 處理外，各處理仍高于對(duì)照。中、低磷肥用量下（20 mg/L 和10 mg/L），不同施氮水平間差異不顯著，而高磷肥用量下，易氧化有機(jī)碳含量隨氮肥的增加而顯著增加（P＜0.05）。中、低氮肥用量下（60 mg/L和40 mg/L），MBC 含量隨磷肥的增加而顯著增加（P＜0.05）。所有施肥處理中以N2P3 處理的MBC 含量最高，幾乎是對(duì)照的6倍。隨著氮肥用量的增加，硝態(tài)氮含量明顯增加，N2P2 和N3P2 增加幅度最大。除了土壤易氧化有機(jī)碳、硝態(tài)氮和產(chǎn)量指標(biāo)外，氮、磷的交互作用對(duì)土壤有機(jī)碳、水溶性有機(jī)碳和微生物量碳含量均有顯著影響（P＜0.05）。

2.2 不同養(yǎng)分組合對(duì)土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)的影響

不同處理各樣本抽平后的有效序列數(shù)為28594。28個(gè)土壤樣本共獲得4 000 個(gè)OTUs，將其進(jìn)行物種分類(lèi)統(tǒng)計(jì)包括：42個(gè)門(mén)、124 個(gè)綱、295個(gè)目、468 個(gè)科和842 個(gè)屬。各處理根際土壤細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)如表2所示。通過(guò)比較分析可以看出滴灌條件下不同養(yǎng)分配施處理改變了土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性。與CK 相比，不同氮磷配施處理Sobs 指數(shù)較對(duì)照均有增加的趨勢(shì)，其中N1P3、N2P1、N2P2 及N3P2 處理顯著增加，N1P3 處理Sobs 指數(shù)最大，達(dá)到1 617，較對(duì)照顯著提高23.15%，而N3P3 處理Sobs 指數(shù)與其他氮磷配施處理相比，數(shù)值最低，為1 348。與Sobs 指數(shù)變化趨勢(shì)相似，不同氮磷配施處理下Shannon 指數(shù)均有增加，N1P3 處理增加幅度最大，達(dá)6.03%，而N3P3 處理的Shannon 指數(shù)最小，較對(duì)照顯著降低14.41%。Sobs指數(shù)與Shannon 指數(shù)均在高氮高磷養(yǎng)分組合下數(shù)值最低。高氮肥用量下（90 mg/L），Simpson 指數(shù)隨磷肥的增加而增加，不同施磷水平間差異不顯著；高磷肥用量下（30 mg/L），Simpson 指數(shù)隨氮肥的增加而降低，不同施氮水平間差異不顯著，除N2P2 處理外，各處理均高于對(duì)照。Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)是衡量群落多樣性的重要指標(biāo)，Shannon指數(shù)越大，表明群落的豐富度和多樣性越高；Simpson 指數(shù)越小，豐富度越大。與CK 相比，N1P2 處理顯著增加了Simpson指數(shù)，表明該處理的群落豐富度最低。

表2 不同養(yǎng)分組合對(duì)土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)的影響Tab.2 Effects of different nutrient combinations on α diversity index of soil bacteria

與CK 相比，N2P3 處理顯著增加了Ace 指數(shù)，N2P1 處理顯著增加了Chao 指數(shù)，表明在N2P3 和N2P1 養(yǎng)分組合處理下物種總數(shù)較對(duì)照有顯著增加的趨勢(shì)。不同氮磷養(yǎng)分組合下代表測(cè)序深度的覆蓋度（Coverage）均無(wú)顯著差異，反映了本次測(cè)序結(jié)果能夠代表所有樣本中微生物的真實(shí)情況和一致性，可以較為準(zhǔn)確的描述樣本的微生物群落信息。

2.3 不同養(yǎng)分組合對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

各處理的根際土壤細(xì)菌在門(mén)分類(lèi)水平和屬分類(lèi)水平的群落組成信息如圖1所示。門(mén)分類(lèi)水平上，各處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似性較高， 主要優(yōu)勢(shì)菌群包括變形菌門(mén)（Proteobacteria，24.24%～55.97%）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria，10.19%～15.13%）、酸桿菌門(mén) （Acidobacteria， 8.18%～15.53%）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi，7.05%～13.86%）、芽單胞菌門(mén) （Gemmatimonadetes， 3.08%～16.12%） 、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes， 3.05%～7.27%）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes，0.87%～5.02%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，1.23%～5.00%）、藍(lán)藻門(mén) （Cyanobacteria， 0.10%～7.52%） 、粘球菌門(mén)（Myxococcota，1.62%～3.74%），這10 個(gè)菌群相對(duì)豐度占土壤細(xì)菌群落的90%以上，其中變形菌門(mén)（Proteobacteria）占比最高。

圖1 門(mén)水平和屬水平根際土壤細(xì)菌群落組成相對(duì)豐度Fig.1 Histograms of relative abundances of bacterial communities in the rhizosphere soil at phylum and genus levels

土壤細(xì)菌群落組成變化對(duì)不同氮磷養(yǎng)分配施處理的響應(yīng)存在差異。與傳統(tǒng)人工施肥處理相比，N1P3、N2P1、N2P2、N3P1 處理降低了Proteobacteria 的相對(duì)豐度，N1P1 和N3P3 處理降低了Chloroflexi 的相對(duì)豐度。滴灌條件下不同的氮磷養(yǎng)分配 施 處 理 下，Actinobacteria、Planctomycetes、Firmicutes 和Myxococcota 的相對(duì)豐度均有增加的趨勢(shì)，而Acidobacteria、Gemmatimonadetes 和Bacteroidetes 表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。屬分類(lèi)水平上，豐度Top 35 的優(yōu)勢(shì)屬占總序列相對(duì)比例的50%～70%，各處理間優(yōu)勢(shì)屬均為假單胞菌屬（Pseudomonas，1.82%～17.07%）、克雷伯氏菌屬（Klwbsiella， 0.50%～19.59%）、Vicinamibacterales（1.93%～6.80%），這些優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度在不同處理間存在較大差異。與CK 相比，N2P1 處理中Pseudomonas 相對(duì)豐度有較大幅度下降，不同氮磷養(yǎng)分配施處理的Pseudomonas 相對(duì)豐度增加幅度表現(xiàn)為N3P3＞N2P3＞N1P1＞N3P2＞N1P2＞N3P1＞N1P3。與CK 相比，不同氮磷養(yǎng)分配施處理降低了芽單胞菌屬（Gemmatimonas）的相對(duì)豐度，而增加了芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度。

2.4 土壤細(xì)菌群落聚類(lèi)特征與環(huán)境因子相關(guān)性分析

基于Bray_Curtis 距離的PCoA 研討滴灌條件下不同養(yǎng)分配施處理與傳統(tǒng)人工施肥土壤的細(xì)菌群落組成的相似性和差異性。圖2 中圖例分別代表不同N 和P 養(yǎng)分組合處理與傳統(tǒng)對(duì)照的土壤樣本，PC1 軸和PC2 軸對(duì)結(jié)果的解釋度分別為23.33%和20.13%。相同處理的樣本并沒(méi)有聚集在同一區(qū)域，傳統(tǒng)人工施肥處理與N1P3、N2P1、N2P2、N2P3、N3P1 處理之間并沒(méi)有區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明N1P3、N2P1、N2P2、N2P3、N3P1 處理對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較低，N1P1、N1P2、N3P2、N3P3 處理分布遠(yuǎn)離傳統(tǒng)人工施肥處理，說(shuō)明N1P1、N1P2、N3P2、N3P3處理對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大。滴灌條件下不同養(yǎng)分配施處理的樣本之間也未清晰的區(qū)分開(kāi)，這可能是樣本本身造成的。結(jié)果表明，不同N和P養(yǎng)分組合處理的土壤細(xì)菌群落組成更加相似，N1P1、N1P2、N3P2、N3P3處理與傳統(tǒng)人工施肥處理的細(xì)菌群落組成存在差異。這說(shuō)明相較于傳統(tǒng)人工施肥，N1P1、N1P2、N3P2、N3P3處理對(duì)根際土壤細(xì)菌群落組成有更大影響。

圖2 不同氮磷養(yǎng)分組合土壤微生物PCoA圖Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of bacterial communities in the rhizosphere of different samples

通過(guò)RDA 揭示不同處理根際土壤樣本細(xì)菌屬水平群落組成與不同環(huán)境因子之間的相關(guān)性（圖3）。結(jié)果表明，RDA1可以解釋12.58%的變異，RDA2可以解釋2.72%的變異，第一主軸和第二主軸解釋了細(xì)菌總變異量的15.3%。與傳統(tǒng)人工施肥處理相比，不同處理的樣品點(diǎn)沒(méi)有明顯分開(kāi)，其中N3P3 處理與CK 處理在RDA1 軸方向上分開(kāi)一定距離，如圖所示，N3P3處理位于RDA1 的正半軸，傳統(tǒng)人工施肥處理位于RDA1 的負(fù)半軸，N3P3處理與傳統(tǒng)人工施肥處理有明顯分異，說(shuō)明N3P3處理對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的影響。易氧化有機(jī)碳、水溶性有機(jī)碳和硝態(tài)氮之間呈銳角，說(shuō)明它們呈正相關(guān)，并存在一定的協(xié)同作用。土壤微生物量碳、硝態(tài)氮、有機(jī)碳、易氧化有機(jī)碳和水溶性有機(jī)碳與根際土壤細(xì)菌群落變化具有明顯的相關(guān)性，說(shuō)明這些環(huán)境因子對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性有影響。

圖3 不同氮磷養(yǎng)分組合菌群與環(huán)境因子的RDAFig.3 Redundancy analysis of bacterial community and environmental factors in different samples

通過(guò)相關(guān)性Heatmap圖分析不同的環(huán)境因子對(duì)根際土壤細(xì)菌屬水平群落組成的影響（圖4）。Pseudomonas與DOC（r=0.058，p=0.768）、EOC（r=0.360，p=0.061）、MBC（r=0.004，p=0.985）和NO3-N（r=0.240，p=0.220）呈負(fù)相關(guān)，而與TOC（r=-0.140，p=0.477） 呈正相關(guān)；MND1和unclassified_f__Comamonadaceae 與TOC 呈顯著正相關(guān)關(guān)系；norank_f__norank_o__Ardenticatenales 與EOC 呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；Arthrobacter 與Altererythrobacter 分別與TOC 呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；Bacillus 與DOC 呈顯著正相關(guān)；Streptomyces 與MBC 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而Solirubrobacter 與MBC 呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果表明根際土壤細(xì)菌群落受土壤理化性質(zhì)的影響，這種差異與不同的水肥管理模式和滴灌條件下不同的氮磷養(yǎng)分濃度有關(guān)。

圖4 環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成Spearman相關(guān)性熱圖Fig.4 Spearman correlation Heatmap to study the environmental factors and bacterial community composition

2.5 物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

選擇分類(lèi)（屬）水平總豐度前40 的物種進(jìn)行物種相關(guān)性分析，圖5（a）為單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)物種與物種之間的相關(guān)關(guān)系繪制網(wǎng)絡(luò)圖，用于反映樣本中物種間的相互作用。屬水平相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖揭示了不同屬之間具有顯著的相互作用（紅色連線(xiàn)表示正相關(guān)，藍(lán)色連線(xiàn)表示負(fù)相關(guān)，連線(xiàn)的粗細(xì)代表相關(guān)性系數(shù)的大小，線(xiàn)的多少表示節(jié)點(diǎn)之間聯(lián)系的密切程度）。結(jié)果表明，土壤Proteobacteria、 Chloroflexi 和Actinobacteria 與其他物種的相關(guān)性較密切， 而Armatimonadota、Firmicutes 和Myxococcota 與其他物種的相關(guān)性較低。40個(gè)菌屬間相關(guān)性程度不同，其中有164個(gè)呈正相關(guān)關(guān)系和33 個(gè)負(fù)相關(guān)關(guān)系。圖5（b）為雙因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系繪制網(wǎng)絡(luò)圖，用于反映樣本中環(huán)境因子與物種間的相互作用。與相關(guān)性Heatmap圖分析結(jié)果一致，MND1、unclassified_f__Comamonadaceae 與TOC 呈顯著正相關(guān)、Bacillus 與DOC 呈顯著正相關(guān)、Streptomyces 與MBC 呈顯著正相關(guān)，Arthrobacter、Altererythrobacter 與TOC 呈顯著負(fù)相關(guān)、Solirubrobacter與MBC呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖5 物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Network analysis applied to the species

3 討 論

3.1 滴灌不同氮磷養(yǎng)分組合對(duì)土壤活性有機(jī)碳庫(kù)的影響

土壤有機(jī)碳是土壤的重要組成部分，不僅在提高土壤肥力和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力方面有著極為重要的作用，而且作為陸地生態(tài)系統(tǒng)重要的碳庫(kù)，對(duì)碳素循環(huán)的平衡也起著重要作用。基于不同的試驗(yàn)條件，氮素添加對(duì)農(nóng)田碳庫(kù)的影響目前尚不存在統(tǒng)一結(jié)論。有研究表明，不同施肥處理下土壤有機(jī)碳含量與碳儲(chǔ)量存在顯著正相關(guān)關(guān)系[20]。徐陽(yáng)春[21]等認(rèn)為，長(zhǎng)期單施化肥不利于土壤有機(jī)碳的保持與提高，氮肥的施用雖能促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，但會(huì)使土壤碳/氮下降，從而增加原有有機(jī)碳和新鮮有機(jī)碳的降解，使土壤有機(jī)碳含量減少。本研究表明，與傳統(tǒng)人工施肥（CK）相比，隨著氮磷施用量的增加，土壤有機(jī)碳含量有不同程度的增加，這與何偉[22]的研究結(jié)果相似。本研究條件下，各施肥處理增加了土壤有機(jī)碳含量，可能是由于水肥一體化實(shí)施過(guò)程中將含有低濃度養(yǎng)分的營(yíng)養(yǎng)液少量多次灌溉于作物根系，改善了枸杞養(yǎng)分利用狀況，減少養(yǎng)分損失，顯著提高了水肥的利用效率，保障土壤根系微生物和作物根系活動(dòng)具有良好的水、氣、熱條件，在一定程度上有利于微生物大量繁殖和有機(jī)物分解，進(jìn)而利于土壤有機(jī)碳的累積。

土壤活性有機(jī)碳通常用易氧化有機(jī)碳（EOC）、水溶性有機(jī)碳（DOC）、微生物量碳（MBC）等指標(biāo)來(lái)表征。Melero[23]等人報(bào)道POXC是評(píng)價(jià)短期和長(zhǎng)期土壤管理措施對(duì)土壤質(zhì)量影響最靈敏和最可靠的指示劑。本研究表明，與對(duì)照相比，水肥一體化處理總體上增加了土壤EOC、DOC 和MBC 含量。這可能是由于氮、磷的施入，提高了土壤微生物酶活性，進(jìn)而加快了EOC 分解速率。DOC 易受土壤pH、微生物量及活性、濕度等因素的影響，水肥一體化條件下，土壤DOC 含量較對(duì)照顯著提高。養(yǎng)分添加能夠顯著提高植物的光合速率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高進(jìn)入到土壤中枯枝落葉的量和根系分泌物的量，從而導(dǎo)致土壤溶解性有機(jī)碳含量增加。土壤MBC 表征土壤微生物活性，與土壤肥力密切相關(guān)。微生物生物量碳對(duì)氮添加的響應(yīng)有所差異，楊雪艷[24]等研究表明，水肥一體化可以顯著提高蔗糖田土壤微生物量碳。N2P3 處理的MBC 含量最高，說(shuō)明合理的氮磷配施能增加土壤微生物量碳的含量。化肥的施用提高了土壤有機(jī)碳的分解速率，降低了土壤的C/N比，改善了土壤環(huán)境，從而增強(qiáng)了微生物活性。同時(shí)，隨著氮肥用量的增加，土壤硝態(tài)氮含量明顯增加，N3P2 增加幅度最大，說(shuō)明過(guò)量施用氮肥，增加了地下水硝態(tài)氮污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。由此可見(jiàn)，合理的氮磷配比，對(duì)于增加土壤碳庫(kù)，提升土壤肥力，提高葉用枸杞芽菜產(chǎn)量具有重要意義。

3.2 滴灌不同氮磷養(yǎng)分組合對(duì)葉用枸杞根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

根際微生物營(yíng)養(yǎng)代謝受氮和磷的共同耦合限制，而根際是土壤微生物最活躍的區(qū)域。通過(guò)不同的氮磷養(yǎng)分配施，改變土壤的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，從而影響土壤微生物群落的多樣性和功能[25]。土壤細(xì)菌群落受環(huán)境變化的影響較大，與傳統(tǒng)人工施肥相比，N1P3、N2P1、N2P2、N2P3 及N3P1 養(yǎng)分組合處理下物種總數(shù)有顯著增加的趨勢(shì)。可以看出，通過(guò)不同氮磷養(yǎng)分配施處理改變了土壤微生物的豐富度和多樣性，在氮磷養(yǎng)分處于中低濃度時(shí)，土壤中的微生物多樣性較高。這與袁穎紅[26]等人和馮慧芳[27]等人對(duì)微生物功能多樣性影響的研究結(jié)果相似，說(shuō)明適量氮的施用能提高土壤微生物的多樣性指數(shù)，而高氮處理則會(huì)抑制土壤微生物的多樣性，施磷會(huì)間接影響土壤微生物群落的功能多樣性，而過(guò)量施磷反而會(huì)抑制土壤微生物的代謝活性。與對(duì)照相比，N1P3、N2P1、N2P2、N3P1 處理Shannon 呈增加趨勢(shì)，但不同養(yǎng)分配施處理間無(wú)顯著性差異，這與不同施肥措施導(dǎo)致土壤微生物多樣性產(chǎn)生差異[28]的結(jié)果矛盾，與劉雨薇[29]的研究結(jié)果一致，這可能是土壤的氮磷累積量在土壤細(xì)菌的承受范圍內(nèi)，因此沒(méi)有對(duì)土壤微生物產(chǎn)生顯著性影響。傳統(tǒng)人工施肥處理和水肥一體化處理的優(yōu)勢(shì)菌群沒(méi)有發(fā)生改變，均為變形菌門(mén)（Proteobacteria），與對(duì)照相比，不同氮磷養(yǎng)分處理變形菌門(mén)（Proteobacteria） 存在差異，N1P3、N2P1、N2P2、N3P1 變形菌門(mén)（Proteobacteria）存在不同程度的下降，這可能是因?yàn)橹袧舛鹊屎椭械蜐舛攘追室种屏藘?yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)。傳統(tǒng)人工施肥處理和水肥一體化處理的屬水平相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化，優(yōu)勢(shì)屬發(fā)生改變，N濃度一定時(shí)，隨P 濃度的增加，假單胞菌屬（Pseudomonas）相對(duì)豐度升高，克雷伯氏菌屬（Klwbsiella）相對(duì)豐度有升高的趨勢(shì)，說(shuō)明假單胞菌屬和克雷伯氏菌屬對(duì)磷肥的敏感性較高。但不同氮濃度相對(duì)豐度沒(méi)有顯著的變化，無(wú)法得出優(yōu)勢(shì)屬與氮之間是否存在靈敏關(guān)系的結(jié)論。

通過(guò)RDA 分析表明，與CK 相比，N3P3 處理差異顯著，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的影響。土壤微生物碳、硝態(tài)氮、有機(jī)碳、易氧化有機(jī)碳和水溶性有機(jī)碳這些環(huán)境因子對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。通過(guò)PCoA 分析表明，N1P1、N1P2、N3P2、N3P3 處理對(duì)根際土壤細(xì)菌群落組成有更大影響。與傳統(tǒng)人工施肥相比，不同氮磷養(yǎng)分配施增加了土壤有效營(yíng)養(yǎng)元素的含量，為細(xì)菌提供充分的養(yǎng)分來(lái)源。同時(shí)，土壤中的碳、氮水平可以調(diào)節(jié)土壤微生物對(duì)其利用的能力，增加土壤相關(guān)酶的活性，從而影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[30]。相關(guān)性Heatmap 圖分析結(jié)果表明，葉用枸杞根際土壤細(xì)菌群落受土壤理化性質(zhì)的影響，不同養(yǎng)分組合因氮磷濃度的不同而對(duì)不同細(xì)菌菌屬的影響程度不同。物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析反映出不同處理與細(xì)菌群落之間的相互作用，并得到了優(yōu)勢(shì)菌屬與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)，與崔丙健[31]等人的研究類(lèi)似，Proteobacteria 和Actinobacteria 與其他物種的相關(guān)性較密切。在葉用枸杞根際細(xì)菌群落組成中，不同的氮磷養(yǎng)分配施會(huì)改變細(xì)菌種群的豐富度和多樣性，而菌群與菌群之間也始終維持著密切的相關(guān)性。氮磷配施處理下土壤通氣狀況良好，為土壤中細(xì)菌菌群提供了良好的活動(dòng)環(huán)境，改善了土壤肥力，有研究表明[32]，土壤有機(jī)碳水平影響著土壤微生物代謝功能多樣性。因此，合理的氮磷配施可以提高土壤有機(jī)碳庫(kù)水平，增加根際土壤微生物群落的豐富度和多樣性，提高土壤微生物代謝速率，進(jìn)而提高土壤保肥能力。

4 結(jié) 論

（1）滴灌條件下不同養(yǎng)分組合會(huì)對(duì)土壤碳庫(kù)特征與葉用枸杞產(chǎn)量產(chǎn)生不同的調(diào)控效應(yīng)。滴灌條件下不同養(yǎng)分組合能不同程度地提高土壤有機(jī)碳含量。各施肥處理的葉用枸杞產(chǎn)量較對(duì)照均有不同程度提高?？傮w來(lái)說(shuō)目前60 mg/L 的氮肥用量，配施30 mg/L的磷肥對(duì)該地區(qū)葉用枸杞的增產(chǎn)效果最好。

（2）土壤活性有機(jī)碳可以快速對(duì)由土壤管理和施肥措施引起的有機(jī)碳的變化做出響應(yīng)。與對(duì)照相比，水肥一體化處理總體上增加了土壤易氧化有機(jī)碳、水溶性有機(jī)碳和微生物量碳含量。

（3）不同氮磷配施對(duì)葉用枸杞根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度的作用效果存在差異，中氮肥用量（60 mg/L）和低磷肥用量（10 mg/L）下，葉用枸杞根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度最高。主要優(yōu)勢(shì)門(mén)有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）等。葉用枸杞根際土壤優(yōu)勢(shì)屬種類(lèi)較少，其中克雷伯氏菌屬（Klwbsiella）相對(duì)豐度最大，土壤有機(jī)碳、易氧化有機(jī)碳、水溶性有機(jī)碳、微生物碳以及硝態(tài)氮含量的變化影響葉用枸杞根際土壤細(xì)菌群落及多樣性變化。