張洪燕，張向榮，唐李李，周超，陸蓉

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是臨床最常見的癡呆類型，嚴重影響患者日常生活及活動。AD患者除智能障礙外，常伴有精神行為癥狀，其中伴攻擊行為總體患病率為40%。攻擊癥狀不僅令患者的照料者感到痛苦，也與患者認知能力下降、獨立性喪失和其他不良預(yù)后指標相關(guān)，增加患者住院風險，是AD治療的重點目標之一[1-2]。

谷氨酸是大腦皮質(zhì)和海馬的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元發(fā)育和突觸可塑性方面發(fā)揮重要作用，參與運動控制、學習和記憶、神經(jīng)發(fā)育等[3]。突觸前和突觸后谷氨酸能系統(tǒng)的缺失和功能障礙與AD的認知功能障礙有關(guān)。研究[4]發(fā)現(xiàn)，離子型谷氨酸受體-6(GRIK2)基因敲除小鼠表現(xiàn)出更明顯的沖動與攻擊性及更少的抑郁樣行為。GRIK2基因rs2227283多態(tài)性與酒依賴、精神分裂癥、雙相障礙患者的攻擊行為均顯著相關(guān)，而酒依賴患者的攻擊行為與GRIK2基因rs6922753多態(tài)性也顯著相關(guān)[5-7]。目前對AD攻擊行為的遺傳學研究發(fā)現(xiàn)主要集中在5-羥色胺系統(tǒng)、多巴胺系統(tǒng)、載脂蛋白E(APOE)，尚無有關(guān)AD患者的攻擊行為和谷氨酸受體基因多態(tài)性之間的相關(guān)研究。

GRIK2基因位于6q16.3區(qū)域，分為17個外顯子，覆蓋約670 kb的區(qū)域。GRIK2有助于抑制性傳遞，調(diào)節(jié)興奮性反應(yīng)，在突觸生理學中發(fā)揮重要作用。本研究分析中國漢族AD患者GRIK2基因rs9390757、rs9399721、rs2227283、rs2518220、rs2852576、rs995640、rs2518170、rs2245817、rs2518306、rs2518242、rs9498663共11個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與攻擊行為之間的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象

為2016年1月至2018年6月在本院老年精神科、南京市祖堂山社會福利院精神科住院的AD患者。入組者符合美國《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)AD診斷標準；其攻擊行為診斷參照國際老年心理協(xié)會(IPA)的標準：①發(fā)生在有認知障礙或癡呆綜合征的患者中；②表現(xiàn)出與情緒困擾行為一致的行為；③表現(xiàn)出過度的運動活動、言語攻擊或身體攻擊；④行為必須造成人際關(guān)系、社會功能方面和/或執(zhí)行或參與日常生活活動的能力的嚴重損害[8]。

排除標準：①患其他腦器質(zhì)性疾病或精神疾病(如抑郁癥)等影響判定認知功能損害性質(zhì)的疾?。虎谟芯萍捌渌窕钚晕镔|(zhì)濫用史。本研究經(jīng)南京腦科醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者或家屬簽署知情同意書。

入組AD患者88例，其中男32例，女56例；平均年齡(78.17±8.54)歲，平均病程(4.79±3.15)年。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 對符合標準的入組患者采集一般資料，進行神經(jīng)認知功能評估，抽取晨空腹上臂靜脈血2 ml用以提取DNA并進行GRIK2基因SNP分析。

1.2.2 認知功能評估 認知評估由經(jīng)培訓的檢查者在專設(shè)的標準化心理檢查室進行，所有受試者均按照相同順序測試。采用簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)評估患者認知功能；采用柯恩-曼斯菲爾德激越情緒行為量表(CMAI)對入組者激越攻擊行為評分。1986年英文版CMAI發(fā)表，用于評定癡呆癥患者的激越情緒和行為；中文版CMAI引自夏仲等2005年《行為醫(yī)學量表手冊》；CMAI分為3個因子：軀體性攻擊行為(13項)、軀體性非攻擊行為(14項)、言語性激越行為(9項)。

1.2.3 GRIK2基因多態(tài)性檢測 在HapMap數(shù)據(jù)庫檢索該基因的標簽SNP，獲得rs9390757、rs9399721、rs2227283、rs2518220、rs2852576、rs995640、rs2518170、rs2245817、rs2518306、rs2518242、rs9498663共11個SNP位點；PCR擴增目的片段：由上海天昊生物科技有限公司提取樣本DNA后，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增目的基因片段。各SNP位點PCR擴增引物序列見表1。反應(yīng)體系：20 μL，包含1×GC-I buffer(Takara)、3.0 mM Mg2+、0.3 mM dNTP、1U HotStar Taq polymerase(Qiagen Inc)、1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性 2 min，(94 ℃變性 20 s，65 ℃退火 40 s，每循環(huán)減0.5 ℃，72 ℃延伸90 s)×循環(huán) 11次，(94 ℃變性 20 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s)×循環(huán) 24次，72 ℃延伸 2 min，4 ℃保溫。多態(tài)性位點檢測：在20 μL PCR產(chǎn)物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h,然后75 ℃滅活15 min。連接反應(yīng)體系：10x 連接緩沖液 1 μL、高溫連接酶 0.25 μL、5'連接引物混合液(1 μM)0.4 μL、3'連接引物混合液(2 μM)0.4 μL、純化后多重PCR產(chǎn)物 2 μL、ddH2O 6 μL 混勻。連接程序：(94 ℃變性1 min，56 ℃退火并連接4 min)×循環(huán)38次，4 ℃保溫。連接產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀：取0.5 μL 稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀，收集的原始數(shù)據(jù)用 GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems,USA)分析,獲得擴增片段的基因序列。

表1 GRIK2基因各 SNP 位點PCR擴增引物

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20軟件進行數(shù)據(jù)處理，Hardy-Weinberg平衡檢驗采用χ2吻合度檢驗；采用PLINK 1.9軟件和加性遺傳模型(Addictive model)對GRIK2基因SNP進行分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者年齡、病程、MMSE、CMAI評分相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示，MMSE評分與病程呈負相關(guān)(r=-0.421，P<0.001)；CMAI評分與年齡、病程、MMSE評分無相關(guān)。見表2。

表2 AD患者年齡、病程、MMSE、CMAI評分相關(guān)性分析(r值)

2.2 遺傳平衡性檢驗(Hardy-Weinberg檢驗)

經(jīng)χ2吻合度檢驗，GRIK2基因rs2518242不符合H-W遺傳平衡(P<0.05)，后續(xù)分析排除此位點；剩余10個位點rs9390757、rs9399721、rs2227283、rs2518220、rs2852576、rs995640、rs2518170、rs2245817、rs2518306、rs9498663符合H-W遺傳平衡(P>0.05)，納入后續(xù)分析。

2.3 GRIK2基因多態(tài)性與CAMI評分相關(guān)性分析

采用一般線性回歸，以年齡、性別作為協(xié)變量，將CMAI評分作為因變量進行分析，統(tǒng)計結(jié)果進行FDR多重校正；rs9390757、rs9399721、rs2227283位點統(tǒng)計結(jié)果經(jīng)過多重校正后仍有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；攜帶rs9390757 C等位基因、rs9399721 C等位基因的患者CMAI評分更高；攜帶rs2227283 A等位基因(β=-0.274,P<0.05)的患者CMAI評分更低。見表3。

表3 AD患者GRIK2基因多態(tài)性與CAMI評分相關(guān)性分析

3 討論

AD患者攻擊行為的發(fā)生機制仍未完全闡明。在神經(jīng)生物學水平上，AD患者的攻擊行為與眶額皮質(zhì)和前扣帶的神經(jīng)纖維纏結(jié)密度增大、右額/顳葉和雙側(cè)扣帶皮質(zhì)代謝減退有關(guān)[9]。從遺傳學角度來看，色氨酸(TRP)羥化酶基因A218C內(nèi)含子多態(tài)性、5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(5-HTTVNTR)等位基因多態(tài)性、5-HTT啟動子區(qū)域的5-HTTPR*L等位基因和*L/*L基因型、多巴胺受體1(DRD1)B2等位基因多態(tài)性、5-HT2A受體基因多態(tài)性(102T基因型)、APOE的e4等位基因與AD的攻擊性之間存在相關(guān)性[10]。環(huán)境因素，如噪音、過度擁擠、缺乏空間和護理人員與患者之間缺乏溝通等，可能增加攻擊行為發(fā)生的可能性[11]?？傊?，現(xiàn)有的證據(jù)表明，神經(jīng)生物學、遺傳學和環(huán)境因素相互作用，促使有易感性的AD患者表現(xiàn)出攻擊性[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的病程與MMSE評分呈負相關(guān)；提示病程越長，患者認知損害程度越重；CMAI評分與年齡、病程、MMSE總分間無明顯相關(guān)，提示AD患者攻擊行為可能是受到其他因素的影響。

本研究分析了中國漢族AD患者攻擊行為與GRIK2基因rs9390757等11個SNP之間的相關(guān)性結(jié)果顯示，rs9390757、rs9399721、rs2227283共3個位點SNP與CAMI評分相關(guān)，其中攜帶rs2227283 A等位基因的患者CMAI評分明顯低于攜帶G等位基因的患者，提示rs2227283基因多態(tài)性可能與AD患者攻擊行為相關(guān)，與既往對酒依賴和精神分裂癥、雙相障礙患者的研究結(jié)果相一致；但是，在他們的研究中，A等位基因是攻擊行為的危險因素，而在本研究中，攜帶A等位基因的患者CMAI評分較低，提示A等位基因是中國漢族AD患者攻擊行為的保護因素，兩者差異可能與不同疾病中攻擊行為的病理機制不同有關(guān)。rs2227283多態(tài)性如何影響攻擊行為的機制尚不清楚，將在今后進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs9390757 C等位基因、rs9399721 C等位基因的患者CMAI評分更高，提示攜帶rs9390757 C等位基因、rs9399721 C等位基因可能是中國漢族AD患者攻擊行為的危險因素。該發(fā)現(xiàn)不僅為AD患者攻擊行為的遺傳學研究提供了依據(jù)，也為其他精神疾病攻擊行為的遺傳學研究提供了更多的基因多態(tài)性位點篩選的可能。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示GRIK2基因rs2227283、rs9390757、rs9399721基因多態(tài)性與AD患者攻擊行為有相關(guān)性，GRIK2基因多態(tài)性是AD患者攻擊行為易感性的潛在遺傳機制之一。但本研究仍存在一些局限性：首先，樣本量相對較小，不應(yīng)排除假陽性結(jié)果的可能。其次，盡管這項研究發(fā)現(xiàn)rs2227283、rs9390757、rs9399721基因位點與AD患者的攻擊行為相關(guān)，但其生物學機制仍不清楚。因此，有必要進行進一步的研究探討確切的生物學機制。