閆盼，王晟東，王姝琪，李靜，方悅，宋明芬

流行病學(xué)調(diào)查[1]顯示，近1/3的成年人發(fā)生過(guò)不同程度的睡眠障礙(SD)；近年來(lái)因睡眠問(wèn)題所帶來(lái)的醫(yī)療費(fèi)用增加和工作效率下降已成為社會(huì)廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。輪班護(hù)士作為特殊職業(yè)的群體，承擔(dān)著緊張、繁雜、高強(qiáng)度的護(hù)理工作，作息無(wú)規(guī)律，其睡眠情況更是不容忽視[3]。研究[4]表明，5-羥色胺(5-HT)作為腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與睡眠的發(fā)生和維持；其功能降低是SD的危險(xiǎn)因素。5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)和5-HT1A受體(5-HTR1A)兩者相互協(xié)調(diào)共同調(diào)控突觸間5-HT濃度[5]。有研究[6]提示5-HTT基因多態(tài)性可能與SD有關(guān)，但結(jié)果存在爭(zhēng)議。經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查通過(guò)(2018004-09)，本研究以SD的高發(fā)人群輪班護(hù)士為對(duì)象，探討5-HTT啟動(dòng)子區(qū)(5-HTTLPR)、內(nèi)含子區(qū)(5-HTTVNTR)及5-HTR1A啟動(dòng)子區(qū)C-1019G位點(diǎn)基因多態(tài)性及其交互作用與輪班護(hù)士發(fā)生SD的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

為2018年10月至2020年10月本院從事輪班制工作>6個(gè)月、18～50歲的護(hù)士138名，排除合并嚴(yán)重軀體疾病或精神心理疾病、正在服用治療失眠藥物者、妊娠或哺乳期婦女及酒精、藥物、濃茶和濃咖啡依賴者；所有入組者對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 采用自編人口學(xué)資料問(wèn)卷，包括性別、年齡、婚姻狀況、職稱(chēng)、輪班年限等。由經(jīng)培訓(xùn)的心理測(cè)量師使用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)量表(PSQI)評(píng)定入組者睡眠狀況，以PSQI總分≥8分為SD組，<8分為非SD組。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 抽取入組者靜脈血2 ml于乙二胺四乙酸抗凝管中，1周內(nèi)使用蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒提取DNA，于-80 ℃保存待用。通過(guò)GenBank查找5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

PCR反應(yīng)體系：dNTP mixture 4 μl，2×GC bufffer I 12.5 μl，上下游引物各1 μl，酶Taq 0.25 μl、模板約50 ng。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火54～62℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。5-HTTLPR、5-HTTVNTR的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳50 min后在分子成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，5-HTR1A C-1019G產(chǎn)物外送測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

根據(jù)PSQI評(píng)分，SD組59例(42.75%)，非SD組79例(57.25%)。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

5-HTTLPR位點(diǎn)SD組(χ2=0.262，P=0.877)與非SD組(χ2=1.028，P=0.598)、5-HTTVNTR位點(diǎn)SD組(χ2=1.771，P=0.413)與非SD組(χ2=3.370，P=0.185)、5-HTR1A C-1019G位點(diǎn)SD組(χ2=0.391，P=0.822)、非SD組(χ2=3.420，P=0.181)與觀察值與期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.3 兩組基因型及等位基因頻率比較

5-HTTLPR:兩組基因型和等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.366，P=0.041；χ2=7.427，P=0.006)，攜帶S等位基因者發(fā)生SD的危險(xiǎn)性較L等位基因者高(OR=1.244，95%CI=1.067～1.451)；5-HTTVNTR：兩組基因型和等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5-HTR1A C-1019G：兩組基因型及等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.991，P=0.001；χ2=19.319；P<0.001)，攜帶G等位基因者發(fā)生SD的危險(xiǎn)性較C等位基因者高(OR=1.428，95%CI：1.246～1.764)。見(jiàn)表3。

表3 兩組5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G基因型及等位基因頻率比較(例數(shù)，%)

2.4 5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用與SD易感性的相關(guān)分析

MDR分析結(jié)果顯示，5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G兩位點(diǎn)模型為最優(yōu)基因-基因交互作用模型，此模型驗(yàn)證樣本準(zhǔn)確度(0.6483)及交叉驗(yàn)證一致性(10/10)均最高，經(jīng)1 000次置換檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0107)；表明5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用與輪班護(hù)士SD易感性有關(guān)，其中攜帶LS/GG、SS/CG、SS/GG基因型組合者為SD高風(fēng)險(xiǎn)基因型個(gè)體。見(jiàn)表4，見(jiàn)圖1。Logistic回歸分析顯示，以LL/CC型為參照，SS/GG基因型輪班護(hù)士發(fā)生SD危險(xiǎn)性明顯增加(OR=9.429，95%CI：1.023～86.857，P=0.043)。見(jiàn)表5。

表4 5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用分析

圖1 5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用模式圖

表5 發(fā)生SD的多因素Logistic回歸分析

3 討論

5-HT是最早被研究的與睡眠有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，5-HTT是5-HT活性的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)5-HTT重?cái)z取作用可在數(shù)量和作用時(shí)間上對(duì)5-HT能神經(jīng)傳遞進(jìn)行精細(xì)調(diào)控[7]。5-HTT編碼基因多態(tài)性可影響5-HTT基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響腦組織中的5-HT水平[8]。本研究選擇5-HTT基因兩個(gè)重要的功能性位點(diǎn)5-HTTLPR和5-HTTVNTR，探討5-HTT基因多態(tài)性與輪班護(hù)士SD易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，5-HTTLPR位點(diǎn)攜帶S等位基因者發(fā)生SD的危險(xiǎn)性較L等位基因者高，但5-HTTVNTR位點(diǎn)各基因型與SD無(wú)關(guān)聯(lián)。本研究的發(fā)現(xiàn)與既往一些研究相似，如Van Dalfsen等[9]通過(guò)開(kāi)展5-HTTLPR多態(tài)性與睡眠模式關(guān)系的初步研究后發(fā)現(xiàn)，攜帶S等位基因的學(xué)生更易持續(xù)處于短暫夜間睡眠模式中。張莉等[10]對(duì)5-HTT基因多態(tài)性與抑郁癥睡眠相關(guān)因子進(jìn)行數(shù)量性狀分析后觀察到，5-HTTLPR多態(tài)性與抑郁癥患者入睡困難、睡眠不深、早醒及睡眠因子評(píng)分密切相關(guān)，具有S等位基因和SS基因型的患者更易產(chǎn)生SD。

5-HTR1A基因位于人類(lèi)染色體5q11.2-13區(qū)域，是哺乳類(lèi)動(dòng)物腦中表達(dá)最多的5-HT受體亞型之一[11]。5-HTR1A作為突觸前自主受體和突觸后受體同時(shí)起作用，突觸前膜的自主受體被激活后可減少5-HT能神經(jīng)元的電活動(dòng)，同時(shí)它還通過(guò)自我反饋控制5-HT能神經(jīng)傳導(dǎo)，突觸后5-HTR1A的激活將引起細(xì)胞膜的超極化，從而降低神經(jīng)元的興奮性[12-13]。5-HTR1A基因存在若干突變位點(diǎn)，其中最為關(guān)注的位點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)C-1019G，該位點(diǎn)基因多態(tài)性已被證實(shí)與人類(lèi)情感障礙的發(fā)生有關(guān)[14-15]，但至今其與SD易感性的關(guān)聯(lián)尚無(wú)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，5-HTR1A C-1019G位點(diǎn)攜帶G等位基因者發(fā)生SD的危險(xiǎn)性較C等位基因者高。從5-HTR1A的作用機(jī)制分析，可能由于G等位基因削弱了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)基因表達(dá)的抑制作用，增加5-HTR1A自身受體的表達(dá)，從而減少5-HT傳遞[16-17]，這可能是其成為易感因素的重要機(jī)制之一。

鑒于5-HTT與5-HTR1A均是5-HT系統(tǒng)神經(jīng)傳遞的重要調(diào)節(jié)因素，而單個(gè)候選易感基因不足以解釋SD的發(fā)生機(jī)制，多個(gè)微效基因的聯(lián)合作用與SD的關(guān)聯(lián)性研究顯得尤為重要。因此，本研究在分別探討了5-HTT(5-HTTLPR、5-HTTVNTR)和5-HTR1A C-1019G各位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)輪班護(hù)士睡眠質(zhì)量影響的基礎(chǔ)上，首次分析基因-基因的交互作用與輪班護(hù)士SD易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G基因存在明顯的交互作用，攜帶SS/GG基因型的個(gè)體SD易感性顯著增加。

但本研究的樣本量偏少、所檢測(cè)的位點(diǎn)較少。結(jié)論有待擴(kuò)大樣本量、探索新的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)一步證實(shí)。