李 瑤，孫中儀，戴 健，蔣海濤，張 鋮，唐曉明*

（1南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京 211100；2.南京江北醫(yī)院骨科，江蘇南京 211500；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院骨科，江蘇淮安 223300）

慢性下腰痛是全球最常見的疾病之一，其主要原因是椎間盤退變（intervertebral disc degenera?tion,IDD）。IDD的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)（extra?cellular matrix,ECM）的丟失，包括II型膠原蛋白（type II collagen,Col II）和聚集蛋白聚糖（aggrecan,Agg）。文獻(xiàn)報(bào)道，在退變的椎間盤組織中血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶4（a disintegrin and metal?loproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4）的表達(dá)升高，其具有降解聚集蛋白聚糖的能力。在髓核（nucleus pulposus,NP）細(xì)胞中，白介素-1β （interleukin-1β,IL-1β） 能明顯增加 AD?AMTS-4基因表達(dá)，同時(shí)在退變的椎間盤組織中核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kap?pa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB）信號(hào)通路活性增加，尤其是其代表性的p65蛋白表達(dá)增高。但目前，尚未有文獻(xiàn)詳細(xì)闡明IL-1β如何控制ADAMTS-4表達(dá)的細(xì)胞機(jī)制，以及在ECM降解中的作用。本次研究以人髓核細(xì)胞為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地探討IL-1β通過(guò)NF-κB p65調(diào)控AD?AMTS-4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，為椎間盤退變研究提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源

組織來(lái)源為35例行椎間盤切除術(shù)患者的切除髓核。該研究得到南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有納入研究的患者都簽署知情同意書。本研究?jī)H包括年齡18～45歲的患者。根據(jù)術(shù)前影像 Pfirrmann 分級(jí)[1]，分為未退變 （Pfirrmann＜III級(jí)）12例，退變（Pfirrmann≥III級(jí)）23例的髓核組織。

1.2 髓核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將組織用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，在0.25%胰蛋白酶中消化20 min，然后在0.2%II型膠原酶、37°C溫水搖床中放置約3 h。隨后通過(guò)70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，獲取的原代NP細(xì)胞接種在DMEM-F12培養(yǎng)基中。本研究采用第一代或第二代細(xì)胞。

1.3 不同劑量IL-1β對(duì)未退變髓核細(xì)胞活力影響

通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8測(cè)定法（cell counting kit-8,CCK-8）測(cè)定用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的IL-1β的最佳濃度。未退變髓核細(xì)胞接種在96孔板中（5 000個(gè)細(xì)胞/孔）。將對(duì)5種不同濃度的IL-1β（0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml） 一起孵育，孵育48 h后，向其中各加入10 μl WST-8試劑，并將細(xì)胞在37°C下孵育2 h。使用Bio-Rad 680酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量孔的吸光度，計(jì)算存活細(xì)胞的百分比。

1.4 退變與未退變髓核組織中標(biāo)志物測(cè)量

分別采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)未退變與退變椎間盤組織獲取的髓核組織中的Agg、P65、ADAMTS-4、Col II和 IL-1β水平。

1.5 退變髓核細(xì)胞處理

將退變髓核細(xì)胞血清饑餓處理以同步細(xì)胞周期，分為3組?？瞻讓?duì)照組不施加任何處理；IL-1β組加入 10 ng/ml IL-1β 作用 24 h；IL-1β+BAY11-7082組，加入BAY11-7082（5.0 μmol/L）預(yù)處理1 h，然后用 IL-1β（10 ng/ml）和 BAY11-7082 處理 48 h[2]。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 RT-PCR檢測(cè)

通過(guò)Trizol從NP細(xì)胞和NP組織中提取總RNA,然后進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒，使用ABI 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）分析mRNA，獲得了循環(huán)閾值，使用2-ΔΔCt值將數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算[3]，重復(fù)測(cè)量3次。基于編碼序列設(shè)計(jì)所有檢測(cè)物的引物見表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)物的編碼序列設(shè)計(jì)

1.6.2 Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白

使用RIPA試劑盒提取總蛋白，提取蛋白過(guò)程中加入蛋白酶抑制劑，防止蛋白降解。并通過(guò)電泳、上膜、封閉后，將需要檢測(cè)的指標(biāo)進(jìn)行一抗、二抗孵育，最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行免疫標(biāo)記。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，資料呈正態(tài)分布時(shí)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析；資料呈非正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β對(duì)未退變髓核細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果

IL-1β對(duì)未退變髓核細(xì)胞細(xì)胞活力影響的CCK-8檢測(cè)結(jié)果見圖1，隨著IL-1β濃度的升高，髓核細(xì)胞的活性逐漸減低，不同劑量IL-1β下未退變髓核細(xì)胞活力的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。因此本次實(shí)驗(yàn)選取10 ng/ml安全劑量作為實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。

圖1 不同濃度的IL-1β對(duì)髓核細(xì)胞活性影響，隨著IL-1β濃度的升高，髓核細(xì)胞的活性逐漸減低

2.2 未退變與退變髓核細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

未退變與退變髓核組織相關(guān)物質(zhì)mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見表2。與未退變髓核細(xì)胞相比，退變髓核細(xì)胞的ADAMTS-4和IL-1β的mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而Agg和Col II的mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表2 未退變與退變髓核細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)mRNA表達(dá)的RTPCR 檢測(cè)結(jié)果 （±s）

表2 未退變與退變髓核細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)mRNA表達(dá)的RTPCR 檢測(cè)結(jié)果 （±s）

未退變與退變髓核細(xì)胞的相關(guān)物質(zhì)蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖2。退變組NF-kB信號(hào)通路標(biāo)志物p65的蛋白表達(dá)水平隨著退變等級(jí)的升高，蛋白表達(dá)量0.86±0.02，顯著高于未退變組的0.63±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖2 Western blot在未退變與退變髓核組織上p65目標(biāo)基因的表達(dá)（G2為未退變組織，G3、G5為退變組織）

2.3 不同處理對(duì)未退變髓核細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)表達(dá)的影響

IL-1β（10 ng/ml）和 NF-kB信號(hào)通路特殊性抑制劑BAY11-7082（5.0 μmol/L）對(duì)未退變髓核細(xì)胞進(jìn)行處理，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見表3。與空白對(duì)照相比，IL-1β可顯著增加未退變髓核細(xì)胞AD?AMTS-4的mRNA表達(dá)，而降低Agg和Col II mRAN的表達(dá)（P＜0.05），而BAY11-7082可非常顯著逆轉(zhuǎn)IL-1β的作用，顯著降低ADAMTS-4的mRNA表達(dá)，而增加Agg和Col II的mRNA表達(dá)（P＜0.05）。

表3 不同處理對(duì)未退變髓核細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表3 不同處理對(duì)未退變髓核細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平結(jié)果見表4及圖3，與空白對(duì)照相比，IL-1β可顯著增加未退變髓核細(xì)胞ADAMTS-4的蛋白表達(dá)，而降低Agg和Col II蛋白的表達(dá)（P＜0.05），而BAY11-7082可非常顯著逆轉(zhuǎn)IL-1β的作用，顯著降低ADAMTS-4的蛋白表達(dá)，而增加Agg和Col II蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。

表4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平結(jié)果（±s）與比較

表4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平結(jié)果（±s）與比較

圖3 Western blot檢測(cè)IL-1β和NF-kB信號(hào)通路特殊性抑制劑作用于髓核細(xì)胞時(shí)，ADAMTS-4、聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋含量的變化

3 討 論

IDD是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，盡管IDD的確切病理生理機(jī)制尚不清楚，但已有文獻(xiàn)研究表明正常椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解處于緩慢生理動(dòng)態(tài)更新狀態(tài)，即合成因子及降解因子相互平衡，一旦這種平衡狀態(tài)被打破，椎間盤退變就會(huì)發(fā)生[4，5]。在降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白酶中，具有血小板反應(yīng)蛋白基序的金屬蛋白酶-4（ADAMTS-4）扮演重要的角色[6]。

本研究根據(jù)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在收集的未退變和退變的椎間盤組織中ADAMTS-4同時(shí)存在，然后比較ADAMTS-4基因的表達(dá)水平時(shí)，與未退變的椎間盤組織相比，退變的椎間盤樣本中AD?AMTS-4的基因表達(dá)顯著增加，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

國(guó)外研究表明ADAMTS-4涉及許多不同的生理功能，最主要的是參與聚集蛋白聚糖的代謝[7]，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制不清楚。國(guó)內(nèi)外研究表明軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中IL-1β能顯著上調(diào)ADAMTS-4的表達(dá)[8，9]。在本研究中，使用IL-1β不同的濃度，來(lái)觀察髓核細(xì)胞的活性，篩選出10 ng/ml作為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)濃度。用IL-1β處理人NP細(xì)胞可明顯誘導(dǎo)AD?AMTS-4表達(dá)。這些結(jié)果與以前的報(bào)道一致，即炎性因子誘導(dǎo)NP中ADAMTS-4 mRNA的表達(dá)[10-12]。雖然其機(jī)制尚不清楚，但有文獻(xiàn)報(bào)道依賴TNF-α的ADAMTS-4在NP細(xì)胞中的表達(dá)可能受NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控[13]。

NF-κB的激活能促進(jìn)炎性因子和基質(zhì)降解酶的表達(dá)的上調(diào)[14-16]。因此，本研究觀察了人椎間盤組織中的NF-κB信號(hào)通路的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著退變等級(jí)的升高，NF-κB信號(hào)通路的活性也隨著升高，聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白顯著降低。提示炎性因子IL-1β可能激活NF-κB信號(hào)通路的異常表達(dá)，進(jìn)而參與IVD退變的過(guò)程。實(shí)際上，NF-κB的慢性活化與多種疾病有關(guān)，包括肌肉骨骼疾病，例如骨關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌營(yíng)養(yǎng)不良癥[17-20]。本研究蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，IL-1β促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的異常活化，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4的表達(dá)增加。為了進(jìn)一步研究IL-1β處理髓核細(xì)胞后ADAMTS-4的表達(dá)是否由NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，在IL-1β處理之前，將NF-κB信號(hào)通路的特異性抑制劑BAY11-7082添加到培養(yǎng)基中，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)BAY11-7082濃度為5.0 μM是安全實(shí)驗(yàn)劑量，BAY11-7082顯著逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)NF-κ信號(hào)通路的激活以及ADAMTS-4表達(dá)的作用，從而導(dǎo)致人NP細(xì)胞中聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白含量的增加。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，通過(guò)控制NF-κB-p65信號(hào)通路的活性，可以調(diào)節(jié)NP細(xì)胞中ADAMTS-4的表達(dá)。同時(shí)，聚集蛋白聚糖降解的加速也可能歸因于NF-κB通路的異常活化，并在IVD退變中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究首次通過(guò)人髓核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子IL-1β通過(guò)促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的異?；罨?，進(jìn)而調(diào)控ADAMTS-4的表達(dá)，更重要的是，ADAMTS-4在細(xì)胞外基質(zhì)聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的降解中起到關(guān)鍵的作用，直接促進(jìn)椎間盤退變的進(jìn)展和加劇。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能為開發(fā)潛在的延緩椎間盤退變的靶點(diǎn)基因，提供重要的參考信息。