李林林，孫敏華，董嘉文，吳彩艷，廖申權(quán)，孫銘飛，呂敏娜，鄺瑞歡，張建峰，徐志宏

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥與診斷學(xué)科群廣東科學(xué)觀測實驗站,廣州 510640; 2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000）

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種高致病性、接觸性傳染病，又稱鴨傳染性漿膜炎（infectious serocitis，IS）。鴨疫里默氏桿菌可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，主要感染1～8周齡，尤其是2～3周齡的雛鴨，引起多發(fā)性、滲出性炎癥和全身性敗血癥[1]。臨床上主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟失調(diào)和頭頸震顫，慢性經(jīng)過的病鴨主要表現(xiàn)為腦膜炎癥狀、頸斜、生長緩慢或成僵鴨。病變以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征[2]。鴨疫里默氏桿菌病發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率高達(dá)75%。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[3]。

鴨疫里默氏桿菌菌體細(xì)胞壁表面的多糖抗原呈多樣性的特征使得鴨疫里默氏桿菌的血清型呈多態(tài)化[4]，目前國際上已確定的鴨疫里默氏桿菌血清型至少有21個（1-21型），國內(nèi)相繼報道了18個血清型。當(dāng)前我國流行的鴨疫里默氏桿菌以血清1型[5]和血清2型[6]為主，這兩種血清型菌株在全國范圍內(nèi)廣泛分布，同時多血清型流行已成為基本態(tài)勢[7]。目前，華南地區(qū)流行的菌株主要為血清1型[8]。鴨疫里默氏桿菌病的防控方法主要為疫苗接種和藥物防治[9]，廣泛應(yīng)用疫苗是預(yù)防該病的有效措施。國內(nèi)已有多家滅活疫苗應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)，但未見關(guān)于鴨傳染性漿膜炎弱毒活疫苗研究的報道，也未見該類疫苗產(chǎn)品問世。因此，研制一種安全有效的預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病的弱毒疫苗對我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展具有重要意義。1型鴨疫里默氏桿菌天然弱毒株SG株（GenBank登錄號：NZ_KB206047）由本單位分離鑒定并進行弱毒疫苗研制。在疫苗制備中，抗原濃度是影響疫苗質(zhì)量和免疫保護效果的關(guān)鍵因素，因此，優(yōu)化鴨疫里默氏桿菌的培養(yǎng)條件提高有效抗原產(chǎn)量對制備疫苗非常必要。高密度發(fā)酵培養(yǎng)可有效提高抗原產(chǎn)量和培養(yǎng)基的利用率，縮短生產(chǎn)周期，減少生產(chǎn)成本，進行低成本的規(guī)模化生產(chǎn)[10]。本研究將通過優(yōu)化鴨疫里默桿菌弱毒株發(fā)酵培養(yǎng)條件，提高抗原產(chǎn)量，為鴨疫里默桿菌弱毒疫苗生產(chǎn)提供了一種有效可行的抗原制備工藝。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑1型鴨疫里默氏桿菌天然弱毒株SG株，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所分離、鑒定并保存。胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XOID公司；大豆蛋白胨、瓊脂粉購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、氯化鈉和磷酸氫二鉀購自生工生物工程（上海）股份有限公司；新生牛血清購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17．0 g、大豆蛋白胨10．0 g、酵母提取物5．0 g、葡萄糖2．5 g、磷酸氫二鉀2．5 g、氯化鈉5．0 g，將上述物質(zhì)溶于ddH2O中定容至1 L，調(diào)整pH值至7．5，混勻后分裝，121℃高壓滅菌30 min。

TSA培養(yǎng)基：在TSB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂粉20．0 g，將上述物質(zhì)溶于ddH2O中定容至1 L，調(diào)整pH值至7．5，混勻后分裝，121℃高壓滅菌30 min，待其自然冷卻至40℃～50℃，加入5%新生牛血清，混勻后制成平板。

1.3 菌種的復(fù)蘇取凍干保存的1型鴨疫里默氏桿菌SG株F6代菌種，用含5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基溶解后，劃線接種于TSA培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)36～48 h，觀察菌落形態(tài)，挑選符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落。

1.4 種子液的制備挑選1型鴨疫里默氏桿菌SG株F6代典型單菌落接種于5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中，置37℃振蕩培養(yǎng)16～20 h。取樣，按體積比1%接種于5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為160 rpm，置37℃振蕩培養(yǎng)12～14 h作為種子液。

1.6 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗運用正交試驗設(shè)計[6]，選取TSB培養(yǎng)基中主要營養(yǎng)成分胰蛋白胨添加量、大豆蛋白胨添加量、酵母提取物添加量、葡萄糖添加量4因素，每個因素3個水平制定正交試驗，見表1。

表1 四因素三水平正交試驗表Table 1 Table of four factors and three levels orthogonal test

采用具有在線控制pH和溶解氧（DO）的5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)。每次試驗加入培養(yǎng)基（pH7．4～7．6）及消泡劑，121℃滅菌30 min，自然降溫。使用前預(yù)熱到37℃，加入5%新生牛血清、1%種子液。培養(yǎng)溫度為37℃，初始通氣量為3 L/min，轉(zhuǎn)速為150 rpm，在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)通氣量使溶氧維持在20%。培養(yǎng)10 h，自4 h開始每隔1 h取樣，參考《中華人民共和國獸藥典》方法用TSA培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗

1.6.1 發(fā)酵培養(yǎng)DO（溶解氧）值的優(yōu)化 按5 L發(fā)酵罐加入適量TSB培養(yǎng)基（pH7．4～7．6）及消泡劑，121℃滅菌30 min，自然降溫。使用前預(yù)熱到37℃，加入5%新生牛血清、1%種子液。培養(yǎng)溫度為37℃，初始通氣量為3 L/min，轉(zhuǎn)速為150 rpm，在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)通氣量使溶氧分別維持在10%、20%、40%。培養(yǎng)10 h，自4 h開始每隔1 h取樣進行活菌計數(shù)。

1.6.2 發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 發(fā)酵前準(zhǔn)備同1．6．1。在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)通氣量使DO值維持在最佳值，分別以轉(zhuǎn)速100、150、200 rpm進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)10 h，自4 h開始每隔1 h取樣進行活菌計數(shù)。

1.7 發(fā)酵液的活菌計數(shù)將收獲的菌液參考《中華人民共和國獸藥典》方法用TSA培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)。

1.8 優(yōu)化配方和優(yōu)化工藝在 GMP 生產(chǎn)車間的發(fā)酵生產(chǎn)根據(jù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果，在GMP 生產(chǎn)車間規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)3 批鴨疫里默桿菌弱毒抗原，采用 50 L 發(fā)酵罐，發(fā)酵液體積為 10 L。分別采集發(fā)酵后4 h開始每隔1 h取樣，進行活菌計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鴨疫里默桿菌弱毒株在發(fā)酵不同時間各組活菌數(shù)的測定發(fā)酵不同時間各組活菌數(shù)測定結(jié)果見表2，正交實驗組別序號5的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的菌液活菌數(shù)最高，發(fā)酵8 h可達(dá)1．22×1010CFU/mL。此組培養(yǎng)基配方是：每升培養(yǎng)基含胰蛋白胨17．5 g、大豆蛋白胨7．5 g、酵母提取物7．5 g、葡萄糖2．5 g、磷酸氫二鉀2．5 g、氯化鈉5．0 g。本實驗室分離到RA天然弱毒SG株，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其生長較強毒株緩慢，通過以上培養(yǎng)基優(yōu)化，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)可獲得較好的生長速率。

表2 發(fā)酵不同時間各組活菌數(shù)的測定結(jié)果Table 2 Results of viable bacteria in different groups at different fermentation time

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)DO值的優(yōu)化結(jié)果當(dāng)DO值分別維持在10%、20%、40%時，SG株發(fā)酵8 h活菌數(shù)分別為1．08×1010CFU/mL、1．29×1010CFU/mL、0．97×1010CFU/mL（表3）。因此，1型鴨疫里默氏桿菌SG株發(fā)酵的最適DO值為20%。

表3 1型鴨疫里默氏桿菌SG株在不同DO值發(fā)酵培養(yǎng)的活菌計數(shù)結(jié)果Table 3 Results of viable bacteria of Riemerella anatipestis SG strain fermented at different DO values

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果當(dāng)轉(zhuǎn)速分別為100、150、200 rpm時，SG株發(fā)酵8 h活菌數(shù)分別為9．8×109CFU/mL、1．19×1010CFU/mL、1．01×1010CFU/mL（表4）；因此，選擇150 rpm為1型鴨疫里默氏桿菌SG株最適發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

表4 1型鴨疫里默氏桿菌SG株不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵培養(yǎng)的活菌計數(shù)結(jié)果Table 4 Results of viable bacteria of Riemerella anatipestis SG strain fermented at different rotational speeds

2.4 GMP生產(chǎn)車間的發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)果根據(jù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果，在GMP生產(chǎn)車間規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默桿菌抗原，采用50 L發(fā)酵罐，發(fā)酵液體積為10 L。結(jié)果顯示，3批1型鴨疫里默氏桿菌SG株培養(yǎng)物均在發(fā)酵8 h活菌數(shù)達(dá)到高峰，活菌數(shù)分別為1．26×1010CFU/mL、1．18×1010CFU/mL、1．21×1010CFU/mL（表5）。該方法較SG株搖床培養(yǎng)到達(dá)菌數(shù)高峰時間（16 h）要提前8 h左右，且活菌數(shù)高。王艷等[12]對鴨疫里默氏桿菌JX-2株進行發(fā)酵培養(yǎng)較搖床培養(yǎng)，提前6 h左右達(dá)到菌數(shù)高峰，楊靈芝等[13]利用液體發(fā)酵裝置對鴨疫里氏桿菌GN52株進行培養(yǎng)，較實驗室培養(yǎng)提前4 h左右達(dá)菌數(shù)高峰，且含菌量提高。因此，本研究獲得的鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件具有較好的優(yōu)越性，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。

表5 1型鴨疫里默氏桿菌SG株不同時間發(fā)酵培養(yǎng)的活菌計數(shù)結(jié)果Table 5 Results of viable bacteria of Riemerella anatipestis SG strain fermented at different time

鴨疫里默氏桿菌病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是對養(yǎng)鴨業(yè)危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。當(dāng)前，鴨疫里默氏桿菌的耐藥性嚴(yán)重，流行的血清型也不斷變化，而已有的滅活疫苗在生產(chǎn)工藝和免疫預(yù)防效果方面均存在較大提升空間，而弱毒疫苗的研發(fā)還未見報道。本研究在華南地區(qū)田間分離得到的1型鴨疫里默氏桿菌自然弱毒株SG株基礎(chǔ)上，通過高密度發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝參數(shù)，縮短了鴨疫里默氏桿菌弱毒株的生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率，為鴨疫里默氏桿菌弱毒疫苗的研制提供了高效的抗原制備工藝。