劉宇婷，徐晶晶，朱豪杰，傅欣玲，童 武，鄭 浩，童光志,2，李國新,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以多種動物奇癢（豬除外）、流產(chǎn)、繁殖障礙為主要特征，危害全球養(yǎng)豬行業(yè)的重要傳染病之一[1-2]。豬是偽狂犬病病毒的唯一自然宿主，感染后的臨床癥狀因豬的日齡不同而各有所異，仔豬感染后常表現(xiàn)為高熱、腹瀉、震顫等癥狀，死亡率能夠達到100%；懷孕母豬的主要癥狀為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎等；公豬的癥狀常為生殖器官腫脹、種用性能喪失[3-4]。70年代gE缺失疫苗Bartha-K61的誕生使偽狂犬病在中國得到控制但沒有完全根除[5]，特別是2011年PRV變異毒株在中國出現(xiàn)，對中國的養(yǎng)豬行業(yè)造成了嚴重的威脅[6-8]。

與其他α皰疹病毒相似，成熟的PRV病毒顆粒由四層結構組成，從內(nèi)到外依次為病毒核心、衣殼、被膜和囊膜[9]。被膜位于衣殼和囊膜之間，為一層無定型、不均勻的物質(zhì)。被膜有多種功能，如與衣殼形成復合體將病毒基因組運輸至細胞核、參與病毒粒子成熟、調(diào)控宿主細胞等。在眾多被膜蛋白中，有7個在皰疹病毒科內(nèi)保守的蛋白，分別為UL7、UL36、UL37、UL51、UL11、UL16、UL21，其中UL11、UL16、UL21蛋白間因相互作用能夠影響病毒衣殼的成熟及病毒粒子的釋放，受到了廣泛的關注[10]。因此，制備針對pUL11、pUL16、pUL21的多克隆抗體可為偽狂犬病病毒被膜蛋白的功能和相互作用研究提供重要的工具。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑pCold-Ⅰ原核表達載體IPTG誘導劑購自索萊寶生物科技有限公司；蛋白marker T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；TaqDNA聚合酶購自寶生物（大連）有限公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑、蛋白酶抑制劑購自美國Sigma-Aldrich公司；His標簽蛋白純化的Nickel磁珠（Biotool）、AlexaFlour 488標記的山羊抗鼠IgG購自Invitrogen公司；SPF級BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α均為本實驗室保存。動物試驗均按照上海獸醫(yī)研究所動物福利委員會的規(guī)定進行操作。

1.2 PRV UL11、UL16、UL21基因的PCR擴增以變異毒株JS-2012感染性克隆質(zhì)粒為模板，PCR分別擴增UL11、UL16、UL21基因，反應體系為：模板20 ng，2×Premix LATaq25 μL，上、下游引物1 μL，ddH2O補齊，反應條件嚴格按照說明書操作。

1.3 重組原核表達載體的構建使用EcoRⅠ和HindⅢ分別對膠回收產(chǎn)物和pCold-Ⅰ空載體進行雙酶切，膠回收酶切PCR片段和pCold-Ⅰ載體，利用T4 DNA連接酶將基因片段UL11、UL16、UL21分別連接至pCold-Ⅰ載體上。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α中，涂于抗性平板后在37℃恒溫放置15 h，將陽性克隆接種培養(yǎng)于抗性培養(yǎng)基中（37℃條件下200 rpm培養(yǎng)24 h），待菌液完全渾濁后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定正確后送公司測序驗證。

1.4 His-UL11、His-UL16、His-UL21重組蛋白原核表達將重組表達載體pCold-UL11、pCold-UL16、pCold-UL21分別轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，涂于抗性平板，37℃恒溫放置10～15 h并觀察陽性克隆生長情況，待有多個單菌落形成后，分別在每個重組表達載體平皿中挑取一個單菌落置于37℃恒溫200 rpm搖床增菌培養(yǎng)，待OD值為0．6時加入濃度為1．0 mmol/L的IPTG，在16℃條件下低溫誘導12 h，同時設置pCold-Ⅰ空載體作為陰性對照。誘導完成后，取100 μL菌液1000×g離心10 min，棄掉上清液后用PBS重懸菌液，加入6×蛋白上樣緩沖液，充分混勻后沸水加熱8 min。將處理好的樣品進行SDSPAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色以檢測重組蛋白是否成功表達。

1.5 蛋白純化將菌液加入到抗性培養(yǎng)基內(nèi)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，待菌液OD值為0．6時開始誘導蛋白的表達，16℃、200 r/min低溫誘導15 h。誘導完成后3000×g離心10 min收集菌液，超聲破碎后收集全蛋白，取100 μL上清液和沉淀樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，以確定融合蛋白的存在形式。隨后，在超聲破碎后的菌體沉淀中加入8 mol/L的尿素緩沖液洗滌包涵體，純化目的蛋白。

1.6 多克隆抗體的制備通過SDS-PAGE凝膠電泳純化目的蛋白并將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，使用脫脂牛奶對PVDF膜進行封閉處理，隨后使用PRV陽性血清作為一抗孵育，對各蛋白的反應原性進行檢測。檢測成功后，將純化好的蛋白作為免疫原，免疫8周齡的BALB/c鼠。第一次將弗氏完全佐劑和蛋白樣品按1∶1混合，使用銀汞調(diào)和器進行乳化，以100 μg/只免疫小鼠。3次加強免疫所用抗原均采用弗氏不完全佐劑進行乳化，乳化的比例為1∶1。免疫方式為皮下多點注射，每隔2周進行1次免疫。在第3次免疫后，眼眶采血，檢測抗體特異性。在第4次免疫后，眼珠采血后按照動物福利規(guī)定處死小鼠。8000×g離心收集各小鼠的血清，保存于-80℃冰箱中。

1.7 Western blot檢測為了檢測多克隆抗體的反應效果，以變異毒株JS-2012感染的PK-15細胞蛋白樣品作為抗原進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，按照1∶500的比例稀釋多克隆抗體，室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗4次，每次10 min；使用HRP標記的抗鼠IgG抗體室溫孵育50 min；孵育完成后，使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，經(jīng)X光片曝光后，觀察抗體反應特異性。

1.8 間接免疫熒光檢測（immunofluorescence assay，IFA）用變異毒株JS-2012（MOI=0．1）感染PK-15細胞36 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，4℃封閉過夜。用新制備的UL11、UL16、UL21蛋白多克隆抗體按照1∶500稀釋后分別作為一抗，在室溫條件下孵育1 h，PBS清洗4次后，用AlexaFluor 488標記的山羊抗鼠IgG抗體繼續(xù)室溫孵育50 min（1∶1000稀釋），同時設置未感染的細胞作為對照，在熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 原核表達載體的構建PCR擴增分別獲得含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點的UL11、UL16、UL21蛋白編碼序列，目的片段長度分別為192 bp、450 bp和603 bp。將純化后的產(chǎn)物連接到pCold-Ⅰ載體上。經(jīng)酶切鑒定和序列測定分析，成功構建了分別含有UL11、UL16、UL21基因的原核表達載體pCold-UL11、pCold-UL16和pCold-UL21。

2.2 重組蛋白表達鑒定將pCold-UL11、pCold-UL16、pCold-UL21分別轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，IPTG低溫誘導后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示，分子量分別在8、20、25 kDa左右（圖1），大小與預期相符，表明成功表達了3種融合蛋白。

圖1 PRV UL11、UL16、UL21重組蛋白原核表達Fig.1 Prokaryotic expression of PRV UL11, UL16, UL21 recombinant proteins

2.3 重組蛋白的純化將pCold-UL11、pCold-UL16和pCold-UL21分別轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)過6 h的增菌后轉(zhuǎn)移至200 mL的LB培養(yǎng)液中，大量誘導目的蛋白表達。菌液經(jīng)過離心和超聲破碎之后，進行SDS-PAGE凝膠電泳驗證。結果顯示，各重組蛋白在沉淀中表達，即以包涵體形式存在（圖2），包涵體蛋白經(jīng)8 mol/L尿素結合緩沖液洗滌后，獲得高純度目的蛋白。

圖2 重組蛋白的表達形式分析Fig.2 Identification of the solubility of the recombinant proteins

2.4 Western blot檢測將純化后的蛋白作為抗原，免疫8周齡BALB/c鼠，完成4次免疫后，眼球采血并收集小鼠血清，隨后利用變異毒株JS-2012感染細胞的蛋白樣品對3種多克隆抗體的特異性進行檢測。Western blot結果表明，3種多克隆抗體均能夠特異性地識別UL11、UL16、UL21蛋白（圖3），蛋白分子量分別在8、38和60 kDa左右，大小正確，表明這3種多克隆抗體具有良好的反應原性。

圖3 多克隆抗體的Western blo t檢測Fig.3 Western blot analysis of polyclonal antibodies

2.5 IFA檢測為了進一步地驗證這3種多克隆抗體的反應原性，將變異毒株JS-2012以MOI=0．1的感染劑量感染PK-15細胞，經(jīng)固定、封閉處理后，按照1∶500的比例對多克隆抗體進行稀釋，室溫孵育細胞1 h，洗滌3次后，二抗避光孵育50 min，最后將樣品置于熒光顯微鏡下觀察。結果表明，新制備的UL11、UL16、UL21重組蛋白多克隆抗體均能夠特異性地識別病毒相對應蛋白，并具有良好的反應效果（圖4）。

圖4 多克隆抗體的間接免疫熒光檢測Fig.4 IFA analysis of polyclonal antibodies

3 討論

自2011年以來，PRV變異毒株在我國出現(xiàn)，經(jīng)典疫苗不再能夠提供原始免疫保護，使我國養(yǎng)豬業(yè)受到重創(chuàng)[11]。本實驗室在對變異毒株的序列分析過程中發(fā)現(xiàn)其基因序列發(fā)生了多處突變，其中UL16基因發(fā)生了明顯的移碼突變[6]。本研究制備的3種多克隆抗體不僅能夠為PRV被膜蛋白功能的研究提供重要工具，也將有助于探究UL16基因?qū)RV變異毒株增殖的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，除囊膜蛋白外，偽狂犬病病毒的被膜蛋白在基因組運輸至細胞核、病毒粒子成熟及調(diào)控宿主細胞的過程中也發(fā)揮著重要的作用[10]。pUL21是皰疹病毒中保守的被膜蛋白之一，其在PRV病毒粒子成熟過程中起到了關鍵性的作用，UL21基因缺失將產(chǎn)生不含病毒基因組的空衣殼[12]，降低成熟病毒粒子中其他被膜蛋白UL46、UL49等的含量[13]。UL16盡管不是病毒復制必需的基因，但UL16的缺失會影響病毒粒子的出芽和在細胞間的傳播[14-15]。pUL11與pUL16二者能夠直接地相互作用，但只有pUL16存在的情況下，pUL11、pUL16和pUL21才能形成復合體[16]，pUL11-pUL16-pUL21復合體不僅對于gE在感染細胞膜上的累積是至關重要[17]，也會影響病毒合胞體的形成和病毒在細胞間的傳播過程[15]。盡管被膜蛋白pUL11、pUL16和pUL21在PRV復制過程中發(fā)揮多種作用，但其具體的功能尚未完全研究清楚，因此制備出針對于PRV被膜蛋白pUL11、pUL16和pUL21的多克隆抗體是至關重要的。

本研究在制備針對UL16和UL21蛋白的多克隆抗體過程中，分別選取了二者編碼蛋白質(zhì)親水性較高的兩段核苷酸序列進行擴增，但誘導蛋白后發(fā)現(xiàn)，其主要以包涵體形式存在，因此我們采取尿素洗滌包涵體的方式，獲得了高純度的目的蛋白。Western blot及IFA結果顯示，3種抗體在1∶500稀釋處理后均能夠與目的蛋白結合，放大靶蛋白信號，具備良好的反應原性。這將為偽狂犬病病毒被膜蛋白功能的研究和相互作用機制的探索提供重要且有效的工具。