劉誼蓉，馮 平，黃振興，李俊彬，蔡 超，羅文亮

(1.西寧市第一人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，青海 西寧 810000；2.青海大學醫(yī)學院 中醫(yī)系，青海 西寧 810016)

免疫球蛋白A腎病(IgA nephropathy，IgAN)是一種系膜增生性腎小球腎炎，是世界范圍內(nèi)最常見的腎小球疾病之一，具有較高的病死率和發(fā)病率[1-2]。在亞洲和歐洲，IgAN的發(fā)病率達到腎活檢的20%～40%，大約40%的患者發(fā)展為終末期腎病[3]。有證據(jù)表明腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是TNF超家族細胞因子的一員，TWEAK通過與其受體成纖維細胞生長因子誘導因子14(fibroblast growth factor-inducible14，F(xiàn)n14)結(jié)合來誘導信號轉(zhuǎn)導[4]。研究表明TWEAK參與了腎臟疾病的病理生理過程，TWEAK/Fn14系統(tǒng)影響IgAN患者的新月體形成和蛋白尿[5]。有研究報道一系列miRNAs在包括IgAN在內(nèi)的腎臟疾病中起關(guān)鍵作用[6]。IgAN患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)、尿液和腎內(nèi)存在多種miRNAs的差異表達[7]。然而，關(guān)于miRNA在IgAN發(fā)病和發(fā)展中的潛在機制尚不清楚。miR-429是miR-200家族的成員之一，作為細胞中的一個調(diào)節(jié)分子，幾乎參與了細胞的所有過程，其中包括細胞增殖及凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生以及組織纖維化過程等[8]。生物信息學分析TWEAK是miR-429的一個靶基因，但關(guān)于miR-429靶向TWEAK調(diào)節(jié)IgAN炎癥反應(yīng)的研究較少。因此，本研究探討miR-429靶向TWEAK對IgAN炎癥反應(yīng)的抑制作用，為IgAN的治療探索潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及IgA-HMC條件培養(yǎng)基的制備 人腎小管近端上皮細胞株(HK2細胞)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，HK2細胞在DMEM/F12[(HyClone，UK)+10%FBS(Gibco，USA)]培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。IgA-人腎小球系膜細胞(human mesangial cells，HMC)條件培養(yǎng)基的制備：從IgAN患者和健康對照者血清中分離純化聚合IgA(PIgA)。細胞用含0.5%胎牛血清和PIgA(終濃度為0.5 mg/mL)的培養(yǎng)液在6孔培養(yǎng)板(1×106個/孔)中培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基(IgA-HMC培養(yǎng)基)，-80℃冷凍保存。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染 用IgA-HMC培養(yǎng)基培養(yǎng)HK2細胞24 h，根據(jù)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使用說明(Invitgen，USA)轉(zhuǎn)染miR-429 mimic和陰性對照(上海吉瑪)，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.3 RNA提取及實時定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑盒(Invitgen，USA)從不同組別細胞提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶法制備模板cDNA。使用Power SYBR qPCR和miRNA qRT-PCR檢測試劑盒在qRT-PCR檢測系統(tǒng)中按照制造商的規(guī)程進行。采用2-△△CT分析相對表達水平。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃初始變性10 min，隨后95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，45個循環(huán)，記錄CT值。

1.4 細胞因子檢測 用ELISA試劑盒(上海茁彩)，按廠家說明書測定IgA-HMC培養(yǎng)液中HK2細胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、IL-6和RANTES的濃度。

1.5 熒光素酶報告試驗 生物信息學軟件預(yù)測TWEAK是miR-429的靶基因，故構(gòu)建野生型及突變型TWEAK-3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的報告基因質(zhì)粒，將報告基因質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒、miR-429 mimic及其陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細胞中，48 h后按照雙熒光素酶檢測說明書進行實驗，根據(jù)螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度比值來反映不同處理組的相對熒光強度。

1.6 Western blot分析 轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細胞并裂解。用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Milliperes，USA)，將膜與一抗NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα(1∶1 000，Abcam)或β-actin(1∶1 000，Abcam)4℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級抗體孵育(1∶2 000，Abcam)在室溫下孵育1 h。ECL暗室顯色，顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，對照組目標蛋白質(zhì)相對含量為1，計算各組蛋白質(zhì)的相對表達量，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-429在IgAN細胞系中的表達 與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)的HK2細胞相比，在IgA-HMC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞miR-429 mRNA表達降低(P<0.05)，見圖1。

A：不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)細胞形態(tài)學圖片；B：miR-429 mRNA表達水平；與對照培養(yǎng)組比較，*P<0.05。

2.2 miR-429靶向TWEAK 雙熒光素酶報告實驗分析，通過靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫篩選，發(fā)現(xiàn)TWEAK基因結(jié)合位點與miR-429互補，可能是miR-429下游的靶基因。克隆了野生型TWEAK 3′-UTR的基因報告質(zhì)粒同miR-429 mimic共轉(zhuǎn)染之后，熒光酶活性被減弱(P<0.05)，而將突變型TWEAK 3′-UTR的基因報告質(zhì)粒與miR-429 mimic共轉(zhuǎn)染之后，并未對熒光素酶活性產(chǎn)生影響(圖2A)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-429 mRNA表達在轉(zhuǎn)染miR-429 mimic后升高(P<0.05)(圖2B)。qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示TWEAK mRNA及蛋白表達均于轉(zhuǎn)染miR-429 mimic后降低(P<0.05)(圖2C)。

A：生物信息學預(yù)測的miR-429-TWEAK結(jié)合位點序列及熒光素酶活性；B：miR-429和TWEAK mRNA表達水平；C：TWEAK蛋白相對表達水平及蛋白條帶；與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 miR-429過表達抑制炎性細胞因子的釋放 與NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-429 mimic后MCP-1、IL-6和RANTES含量及mRNA表達降低(P<0.05)，見圖3。

與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 miR-429過表達抑制NF-κB活化 與NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-429 mimic后NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達降低(P<0.05)，見圖4。

與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

IgAN是原發(fā)性腎小球腎炎的主要形式，涉及終末期腎功能衰竭、透析和腎移植。雖然越來越多的證據(jù)表明，糖基化IgA的異常產(chǎn)生及其作為免疫復(fù)合物沉積到腎小球?qū)е翴gAN的發(fā)病[9]。然而，目前IgAN的發(fā)病機制尚不完全清楚，較為公認的是多重打擊學說，即第一次打擊血清內(nèi)增多的半乳糖缺乏型IgA1(Gd-IgA1)，第二次打擊針對Gd-IgA1鉸鏈區(qū)的特異性免疫，第三次打擊免疫復(fù)合物的形成及補體和免疫細胞的參與，第四次打擊系膜細胞的增殖及腎小球濾過率的降低，且對IgAN尚無普遍的治療方法[10]。因此，更好地了解IgAN的分子機制將為IgAN的治療策略提供新的見解。

miRNAs是調(diào)節(jié)基因表達的短的、非編碼的RNA分子，腎臟miRNA表達的基因芯片分析已經(jīng)確定了一些與維持腎臟穩(wěn)態(tài)和腎臟疾病相關(guān)的新miRNAs[11]。有研究認為miRNA可能在IgAN的發(fā)病和發(fā)展中起重要作用，在IgAN背景下，外周血單個核細胞miRNA圖譜的全基因組分析表明，B淋巴細胞miR-148B的異常表達可能是IgA1糖基化異常的原因，并在發(fā)病的早期階段發(fā)揮核心作用，參與IgAN發(fā)病第一次打擊[12]。另一方面，腎內(nèi)miR-29c水平對于調(diào)節(jié)腎臟纖維化和IgAN進展的后期階段非常重要[13]。此外，miR-200c、miR-141、miR-205、miR-192、miR-146a和miR-155在IgAN患者中均異常表達，并與IgAN的嚴重程度和進展有關(guān)[14]。近年來，miRNA在IgAN中的作用機制成為研究者關(guān)注的焦點。研究報道，在IgAN發(fā)病過程中miR-29b-3p表達降低上調(diào)CDK6并增強炎癥[15]。此外，Bao等[16]研究顯示抑制miR-21可通過阻止IgAN中PTEN/Akt通路的激活來阻止足細胞和腎小管上皮細胞的纖維化激活。因此，充分研究miRNA在IgAN中的作用機制，有助于疾病特異性治療。miR-429與其余4個成員(miR-200a、miR-200b、miR-200c及miR-141)一起組成miR-200家族，參與包括腫瘤細胞增殖凋亡、炎癥、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、纖維化、生殖等眾多過程，但miR-429仍有巨大的空間有待發(fā)掘[17]。本研究的結(jié)果顯示miR-429在IgAN細胞系中的表達明顯下調(diào)，提示miR-429可能參與了IgAN的發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)TWEAK和Fn14的表達增加與腎臟疾病患者和腎臟損傷動物模型有關(guān)[18]。TWEAK可通過刺激腎小管上皮細胞中經(jīng)典和非經(jīng)典NF-κB途徑，誘導促炎癥細胞因子和趨化因子(如單核細胞趨化蛋白-1和RANTES)的表達[19]。同樣，在小鼠模型中，TWEAK的基因消融抑制了腎臟炎癥和纖維化的誘導，而TWEAK的過表達促進了腎梗阻的誘導[20]。而NF-κB通路的激活也與IgAN的調(diào)節(jié)有關(guān)[21]。因此，在IgAN的進展過程中存在TWEAK/Fn14 NF-κB軸。在本研究中，通過基因庫篩查發(fā)現(xiàn)TWEAK具有與miR-429相結(jié)合的互補序列，雙熒光素酶報告實驗證實TWEAK是miR-429的下游靶向調(diào)控分子；轉(zhuǎn)染miR-429 mimic后TWEAK mRNA及蛋白表達均降低。提示靶向TWEAK可能是miR-429發(fā)揮抗IgAN的重要機制。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-429后促炎癥細胞因子和趨化因子(MCP-1、IL-6和RANTES)含量及mRNA表達降低，NF-κB通路相關(guān)因子NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達也降低。提示miR-429過表達可能通過阻止TWAKE介導的NF-κB途徑活化來減少IgAN中炎性細胞因子的釋放，進而減輕IgAN炎癥反應(yīng)。

綜上所述，miR-429在IgAN細胞系中下調(diào)，miR-429過表達可能通過阻止TWAKE介導的NF-κB途徑活化來減少IgAN中炎性細胞因子的釋放，進而可能影響IgAN免疫狀態(tài)，可能參與IgAN發(fā)病機制多重打擊學說中的第三次打擊，miR-429可能是IgAN一種新的治療靶點，而miR-429影響免疫狀態(tài)的作用還需進一步研究。