何旭東，鄭紀(jì)偉，田雪瑤，教忠意，竇全琴

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153)

薄殼山核桃（Carya illinoensis(Wangenh.) K.Koch）屬胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya），又稱碧根果、長(zhǎng)山核桃、美國(guó)山核桃，自然分布于美國(guó)和墨西哥北部，為一種多年生高大落葉喬木。現(xiàn)以美國(guó)為產(chǎn)業(yè)中心，分為東南、中南、西南和北部四大商業(yè)化產(chǎn)區(qū)，涵蓋全美24個(gè)州[1]。薄殼山核桃是典型的果材兼用型樹種。其堅(jiān)果產(chǎn)量高、殼薄個(gè)大、營(yíng)養(yǎng)豐富，是大眾頗為喜愛的保健食品；種仁含油量高達(dá)70%以上，不飽和脂肪酸超97%，優(yōu)于茶油、花生油等，是世界重要的木本油料植物[1-3]。薄殼山核桃因其世代周期長(zhǎng)、樹形優(yōu)美、樹勢(shì)挺拔，也是重要的景觀綠化樹種；其木材結(jié)構(gòu)細(xì)密、堅(jiān)固強(qiáng)韌、紋理美觀，可用于軍工、建筑以及制作高檔家具和工藝品，屬于珍貴用材樹種[1-3]。

我國(guó)引種薄殼山核桃已有百年歷史，前期主要引進(jìn)種子及苗木，后期開始引進(jìn)系列良種，并進(jìn)行自主選育與栽培推廣。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近年來江蘇、浙江、安徽、四川、云南等省份陸續(xù)引進(jìn)和保存的薄殼山核桃品種超過100個(gè)[4]，相繼審（認(rèn)）定的良種超過40個(gè)，包括美國(guó)引進(jìn)與自主選育的品種[5]。但薄殼山核桃品種選育多利用種子繁殖，后代變異大且童期較長(zhǎng)，目前栽培推廣的大多仍是從美國(guó)引進(jìn)的品種。由于薄殼山核桃品種引進(jìn)均為種條，形態(tài)相似難以區(qū)分，且前期引種歷史較長(zhǎng)、引種程序不規(guī)范，各地間相互頻繁引種難免造成品種間相互混雜混淆，甚至直接改換國(guó)外品種名稱，造成同物異名或同名異物的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，這也給薄殼山核桃品種種質(zhì)評(píng)價(jià)、遺傳改良以及面上推廣工作帶來極大的不便。因此，對(duì)薄殼山核桃品種進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)與鑒定，不僅有助于保護(hù)林木植物新品種權(quán)、保障所有權(quán)人的利益，而且能從根本上保證我國(guó)薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)的商業(yè)化發(fā)展。

分子標(biāo)記技術(shù)不受外界環(huán)境及人為因素的影響，可直接反映不同個(gè)體間DNA 水平上的差異，實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果穩(wěn)定可靠，已廣泛應(yīng)用于林木遺傳學(xué)及基因組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。在薄殼山核桃親緣關(guān)系分析與品種鑒定方面，前期已有RAPD[6-8]、ISSR[9]、SRAP[10]、SSR[11-12]、SNP[13]、DNA 條 形碼[14]和葉綠體基因組[15-16]等眾多標(biāo)記的研究。與顯性標(biāo)記相比，SSR 標(biāo)記在基因組中各個(gè)區(qū)域廣泛分布、數(shù)量極大、變異豐富，且為共顯性遺傳，是目前使用最廣泛的一種分子標(biāo)記[17]，尤其是結(jié)合熒光標(biāo)記高通量基因分型技術(shù)，已成功應(yīng)用于楊樹[18]、柳樹[19]、櫟樹[20]、刺槐[21]、含笑[22]、桂花[23]等多個(gè)木本植物指紋圖譜的構(gòu)建研究。國(guó)內(nèi)薄殼山核桃分子生物學(xué)的研究起步較晚，在指紋圖譜構(gòu)建方面尚未見相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究選取薄殼山核桃及其近緣種開發(fā)的SSR 標(biāo)記，經(jīng)篩選后利用熒光標(biāo)記并對(duì)25個(gè)美國(guó)引進(jìn)品種進(jìn)行基因分型，用以構(gòu)建指紋圖譜并分析其親緣關(guān)系，旨在建立一種快速、穩(wěn)定、可靠的薄殼山核桃基因分型體系，為薄殼山核桃品種改良工作提供有益參考，同時(shí)也為薄殼山核桃遺傳資源的鑒定與品種保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與DNA 提取

本研究所用25個(gè)薄殼山核桃品種均從美國(guó)引進(jìn)，定植于江蘇省句容市南京林業(yè)大學(xué)薄殼山核桃種質(zhì)資源圃內(nèi)（表1）。采集所有品種幼嫩葉片，利用試劑盒（天根生化科技有限公司，DP305）按說明書步驟提取葉片總DNA。分別使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA 的完整性、純度與濃度。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Experimental materials

1.2 引物篩選與通用性檢測(cè)

從前期已發(fā)表的薄殼山核桃及其近緣種SSR標(biāo)記中挑選54 對(duì)通用性較高的引物，并隨機(jī)選擇16個(gè)品種為模板進(jìn)行引物初篩。經(jīng)高分辨率瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最終確定10 對(duì)SSR 標(biāo)記用于后續(xù)分析（表2）。用熒光基團(tuán)標(biāo)記所有引物前項(xiàng)5′端，交由生物公司進(jìn)行合成。

表2 10 對(duì)SSR 引物信息Table 2 Details of 10 SSR primer pairs

采用10 μL PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行引物初篩，包含1 μL DNA 模板，各0.4 μL 前后項(xiàng)引物，5 μL PCR Mix（上海生工Taq PCR Mix 預(yù)混液，2×，含藍(lán)染料），3.2 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增程序按以下步驟進(jìn)行：首先94℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35 次；最后72℃延伸10 min。

1.3 基因分型體系建立

基因分型PCR 反應(yīng)為25 μL 體系，包含1 μL DNA 模板，各1 μL 前后項(xiàng)引物，1 μL dNTP，2.5 μL Taq Buffer（含MgCl2），0.5 μL Taq 酶，18 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增程序按以下步驟進(jìn)行：首先95℃預(yù)變性3 min；其次94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)10 次；隨后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35 次；最終72℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物中加入HiDi 與LIZ 500 內(nèi)標(biāo)，經(jīng)98℃變性5 min 后迅速移至冰上進(jìn)行冷卻，隨后放置于ABI 3730 XL 全自動(dòng)DNA 測(cè)序儀內(nèi)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用測(cè)序儀自帶的Genemapper 軟件統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)基因分型數(shù)據(jù)；使用MSA 軟件計(jì)算各位點(diǎn)等位基因數(shù)（A）和多態(tài)信息含量（PIC）等數(shù)據(jù)；使用NTSYS-pc 軟件中Qualitative data 模塊計(jì)算兩兩個(gè)體間遺傳相似系數(shù)（GS）：GS= 2Nij/（Ni+Nj），式中：Nij為i和j共有的譜帶數(shù)，Ni和Nj為i和j個(gè)體的譜帶數(shù)，以clustering 程序中SHAN 進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記多態(tài)性分析

以25個(gè)薄殼山核桃品種為模板，檢驗(yàn)10 對(duì)熒光SSR 標(biāo)記多態(tài)性情況。表3 表明 ：10 對(duì)SSR標(biāo)記共擴(kuò)增出68 條等位片段，平均6.8個(gè)，其中，位點(diǎn)BFU-Jr19 擴(kuò)增的等位基因數(shù)最少（3個(gè)），位點(diǎn)Cc19 擴(kuò)增的等位基因數(shù)最多（12個(gè)）。10個(gè)SSR 標(biāo)記的多態(tài)信息含量（PIC）的變化范圍為0.291 0～0.843 5，平均0.588 3，其中，位點(diǎn)Cc19的PIC 值最高，位點(diǎn)BFU-Jr82 的PIC 值最低。圖1為位點(diǎn)PM-CIN4 在部分薄殼山核桃品種中的基因分型結(jié)果。

圖1 位點(diǎn)PM-CIN4 在薄殼山核桃部分品種中的基因分型Fig.1 Genotyping by locus PM-CIN4 for partial varieties of Pecan.

表3 10 對(duì)SSR 標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Table 3 Polymorphism detection of the 10 pairs of SSR markers

2.2 品種指紋圖譜構(gòu)建

對(duì)10個(gè)SSR 位點(diǎn)擴(kuò)增的等位片段做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)不同標(biāo)記間相互組合，最終確認(rèn)4 對(duì)核心引物的組合可用于25個(gè)薄殼山核桃品種指紋圖譜的構(gòu)建。表4 表明：標(biāo)記Cc19 可以區(qū)分11個(gè)品種，標(biāo)記PM-GA31 能區(qū)分10個(gè)品種，標(biāo)記PM-CIN4 能區(qū)分6個(gè)品種。通過引物Cc19、PMGA31 與PM-CIN4 的組合可區(qū)分21個(gè)薄殼山核桃品種，加入標(biāo)記PM-GA41 后，4 對(duì)引物組合可完全區(qū)分薄殼山核桃的25個(gè)品種。

表4 25個(gè)薄殼山核桃品種的指紋圖譜Table 4 Fingerprint of 25 varieties of Pecan

2.3 聚類分析

計(jì)算各品種間遺傳相似系數(shù)，并按UPGMA法進(jìn)行聚類（圖2）。25個(gè)薄殼山核桃品種間遺傳相似系數(shù)在0.62～0.99 之間，并聚類成2個(gè)大的類群。

圖2 25個(gè)薄殼山核桃品種的聚類Fig.2 Dendrogram of 25 varieties of Pecan

第一個(gè)大的類群包含9個(gè)薄殼山核桃品種，其中，‘Schley’自由授粉子代‘Cape Fear’與‘Schley’雜交子代‘Oconee’聚成一個(gè)小的分枝，并與品種‘Choctaw’聚在一起，而‘Choctaw’的一個(gè)親本‘Mahan’也是‘Schley’實(shí)生子代。其他品種如‘Mandan’、‘Nacono’、‘Tejas’和‘Shoshoni’因雜交親本差異較大，各品種間的親緣關(guān)系也相對(duì)較遠(yuǎn)。第二個(gè)大的類群包含16個(gè)薄殼山核桃品種，其中，來源于實(shí)生苗的品種‘Hirschi’與‘Kiowa’親緣關(guān)系較近；品種‘Mohawk’、‘Schley’、‘Western’和‘Jackson’聚類成一個(gè)小的分枝，其中‘Mohawk’一個(gè)親本為‘Mahan’，而‘Mahan’也是‘Schley’實(shí)生子代；‘Western’又名‘Western Schley’，雖然來源于實(shí)生苗選育，但其性狀與‘Schley’極為相似；而‘Jackson’為雜交選育，其中的一個(gè)親本即為‘Schley’。其余幾個(gè)品種如‘Navaho’、‘Wichita’和‘Pawnee’雖然親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但追溯其親本來源，均與品種‘Schley’相關(guān)。

3 討論

薄殼山核桃為雌雄同株，一般通過控制授粉進(jìn)行雜交，再收取種子進(jìn)行子代測(cè)定，進(jìn)而選育新的品種。從表1 可以看出，本研究選取的25個(gè)薄殼山核桃品種中，有一半的品種直接與‘Schley’相關(guān)，或是通過‘Schley’的子代進(jìn)一步雜交選育的品種，可見薄殼山核桃品種間的遺傳基礎(chǔ)較狹窄，品種間的形態(tài)極為相似，很難通過表型性狀進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，而基于分子標(biāo)記技術(shù)的指紋圖譜無疑是進(jìn)行快速鑒定的重要技術(shù)手段。同時(shí)，基于林木新品種權(quán)申請(qǐng)與保護(hù)的需要，也可提交分子標(biāo)記指紋圖譜作為輔助證據(jù)[28]。SSR 為共顯性標(biāo)記，基因分型時(shí)能區(qū)分純合子與雜合子，且SSR 標(biāo)記變異程度高，不但能夠區(qū)分親緣關(guān)系較近的種，甚至能夠鑒定同一個(gè)雜交組合中的不同個(gè)體，如在核桃中就有過類似報(bào)道[29]。此外，如圖1 所示，基于熒光SSR 標(biāo)記聯(lián)合高通量測(cè)序儀的基因分型技術(shù)，相比傳統(tǒng)的PAGE 膠更加直觀、快速、準(zhǔn)確，特別是針對(duì)差異較小的等位片段有著更高的分辨率[30]。

SSR 標(biāo)記廣泛分布于植物基因組的各個(gè)區(qū)域，通常包含EST-SSR、基因組SSR（genomic SSR）和葉綠體SSR（cpSSR）3種類型。EST-SSR 來源于基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域，其序列相比基因組SSR 更加保守，種間通用性較高但多態(tài)性較低[31]。有研究表明：EST-SSR 標(biāo)記不僅可應(yīng)用于種間及屬間[32-33]，甚至在亞科間與科間均表現(xiàn)出較高的通用性[34-35]。本研究中有2個(gè)EST-SSR 標(biāo)記（Cc19、Cc14）來源于山核桃（C.cathayensis，胡桃科山核桃屬），3個(gè)EST-SSR 標(biāo)記（BFU-Jr19、BFU-Jr82、Zm26）來源于核桃（Juglans regia，胡桃科核桃屬），可見EST-SSR 標(biāo)記在同屬不同種間、甚至屬間均表現(xiàn)出較好的通用性用性。此外，Li等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)：從山核桃中開發(fā)的311個(gè)標(biāo)記有63.02%可以用于山核桃屬的其他樹種，如薄殼山核桃、大別山山核桃（C.dabieshanensis）和湖南山核桃（C.hunanensis）等。從核桃中開發(fā)的EST-SSR 標(biāo)記在核桃屬（Juglans）、山核桃屬（Carya）以及喙核桃屬（Annamocarya）不同樹種中通用性均較好[26]。

本研究選取的10個(gè)SSR 標(biāo)記中，有5個(gè)標(biāo)記為基因組SSR 標(biāo)記（PM-CIN4、PM-GA31、PMGA38、PM-GA41、WGA70），5個(gè)為EST-SSR 標(biāo)記（Cc19、Cc4、BFU-Jr19、BFU-Jr82、Zm26）。從表3 中PIC 數(shù)據(jù)可以看出，盡管EST-SSR 標(biāo)記Cc19 的值最大，但總體而言，基因組SSR 標(biāo)記的多態(tài)性相比較于EST-SSR 標(biāo)記要高。通常認(rèn)為，高度多態(tài)位點(diǎn)的PIC 值一般大于0.5，中度多態(tài)位點(diǎn)的PIC 值一般在0.25～0.5 之間，低度多態(tài)位點(diǎn)的PIC 值一般小于0.25[36]。本研究中，有6個(gè)標(biāo)記PIC 值大于0.5，4個(gè)標(biāo)記PIC 值在0.25～0.50之間，總體標(biāo)記的多態(tài)性較高。

聚類分析中，25個(gè)薄殼山核桃品種聚成了2個(gè)大的分枝，各個(gè)品種之間的聚類與遺傳背景之間沒有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。雖然一些品種從遺傳背景看，親緣關(guān)系應(yīng)該較近，如‘Forkert’和‘Jackson’均為‘Success’與‘Schley’的雜交子代，‘Choctaw’與‘Mohawk’均為‘Success’與‘Mahan’的雜交子代，但聚類時(shí)并沒有聚在一起。又如‘Cape Fear’、‘Mahan’與‘Sumner’，均為‘Schley’子代，盡管只有一個(gè)親本不一樣，但彼此間的親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)。類似的情況在Conner等[6]以及Grauke等[11]的研究中也有過報(bào)道。推測(cè)可能是由于薄殼山核桃為多年生高大喬木，世代周期較長(zhǎng)，遺傳背景復(fù)雜且高度雜合，雜交子代遺傳分化較嚴(yán)重造成的。此外，標(biāo)記的數(shù)量、類型以及不同的聚類方法均會(huì)對(duì)聚類結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。因此，在后期的研究中，一方面要加入各個(gè)品種的雜交親本，另一方面要挑選覆蓋全基因組范圍、一定數(shù)量、效率更高的標(biāo)記，才能最大程度揭示薄殼山核桃品種間親緣關(guān)系的真實(shí)水平。

4 結(jié)論

薄殼山核桃品種間遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，外觀形態(tài)極為相似，僅從表型性狀難以進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。本研究基于熒光SSR 標(biāo)記開展了25個(gè)美國(guó)薄殼山核桃品種親緣關(guān)系分析與指紋圖譜構(gòu)建研究，篩選出的10 對(duì)SSR 引物多態(tài)性較高，建立的基因分型體系穩(wěn)定且可靠，可為薄殼山核桃種質(zhì)鑒定及品種保護(hù)提供有效方法，也可為薄殼山核桃遺傳資源的引進(jìn)及雜交育種親本的選配提供科學(xué)依據(jù)。