鐘傳鈺，鄭元義

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200233)

人體毛細(xì)血管直徑小于10 μm[1]，而數(shù)量極其龐大；微血管改變可作為診斷疾病和評價預(yù)后的有效指標(biāo)，但目前肉眼無法識別小于100 μm血管所形成的微循環(huán)[1]。MRI、CT、核素顯像和超聲的分辨率僅為亞毫米或毫米級。超聲超分辨率微血流成像(ultrasound super-resolution microcirculation imaging, USRmi)為解決相關(guān)問題帶來了希望。本文就USRmi起源、超聲定位顯微鏡具體操作步驟及其臨床前應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 USRmi起源

超聲超分辨率成像提出于20世紀(jì)80年代[2]，以分離來自比經(jīng)典衍射極限更接近源的回波。超聲成像的分辨率極限與波長有關(guān)，波長減小則超聲波吸收顯著增加，波長過短會對成像深度構(gòu)成限制，故臨床超聲成像分辨率的極限為百微米[3]。2006年，熒光光激活定位顯微鏡(fluorescence photoactivated localization microscopy, FPALM)、光激活定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy, PALM)和隨機光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)等新技術(shù)的出現(xiàn)打破了光學(xué)衍射極限[4-6]；受其啟發(fā)，超聲超分辨率成像的基本思想是基于系統(tǒng)點擴散函數(shù)(point spread function, PSF)定位每個隨機閃爍的熒光源的質(zhì)心，其位置信息堆疊于快速相機捕獲的實質(zhì)性順序數(shù)據(jù)集上，形成以亞波長分辨率實現(xiàn)空間分辨率的圖像，由此實現(xiàn)數(shù)十納米的空間分辨率。ZHENG等[7]于2009年提出以超聲造影(contrast enhanced ultrasound, CEUS)測量小血管內(nèi)流速，采用諧波超聲成像技術(shù)跟蹤超聲微泡在高幀頻下的運動，后經(jīng)不斷改進(jìn)而形成超聲定位顯微鏡(ultrasound localization microscopy, ULM)技術(shù)，通過順序觀察不同微泡，可避免微泡之間的干擾，于每幀圖像中檢出孤立的源；已知射頻通道數(shù)據(jù)或波束形成圖像的PSF時，可對微泡進(jìn)行微測量精度定位，并通過積累亞波長定位而生成超分辨率微血管圖。

2012年，ROY等[8]嘗試針對超聲微泡直接及以多普勒角度獨立測量小血管內(nèi)血流速度，利用諧波超聲成像跟蹤微泡運動，并計算在體兔耳中心動脈平均流速。SIEPMANN等[9]采用上述方法檢測在體質(zhì)心，以改善稀微氣泡最大強度投影技術(shù)。至2013年，ULM已可區(qū)分體外兩支相距小于半個波長的血管[10]。之后出現(xiàn)了1.5D陣列[11]和半球陣列[12]兩種三維超分辨率方法，成功將超分辨率成像應(yīng)用于小鼠耳部模型[13]和大鼠大腦模型[3]。

2 ULM技術(shù)步驟

圖1所示為不同ULM技術(shù)的共同基礎(chǔ)[1]。

圖1[1] USRmi處理步驟 (Acquisition：獲??；Detection：檢測；Isolation：分離； Localization：定位；Tracking：追蹤；Mapping：映射)

2.1 導(dǎo)入微泡 目前超分辨率定位單個微泡均涉及造影劑導(dǎo)入途徑[1]?；径ㄎ环椒ㄒ笪⑴轁舛茸銐虻?，以便在處理后濾波后利用圖像系統(tǒng)衍射的有限PSF實現(xiàn)氣泡空間分離；基于稀疏的方法[14]和基于深度學(xué)習(xí)(deep learning， DL)方法[15-16]可滿足上述要求，并允許較高濃度。

2.2 采集錄像 將B模式超聲脈沖發(fā)射到含有微泡的介質(zhì)中后，以常規(guī)或超快幀速率獲取微泡流錄像，并收集基于每個通道射頻數(shù)據(jù)的矩陣或波束形成的圖像數(shù)據(jù)[1]。

2.3 運動校正 通常針對最小血管采集長錄像。超分辨率圖像由疊加局部變化而產(chǎn)生，幀的運動顯著影響其可視化，且臨床面對的運動尺度常常較大，故運動校正至關(guān)重要。

2.4 檢測微泡 區(qū)分微泡與周圍組織為關(guān)鍵步驟之一，為后續(xù)定位提供候選區(qū)域，以便最終繪制圖像；檢測不足意味著定位困難[1]。錯誤信號過多給后續(xù)濾波過程帶來挑戰(zhàn)，為圖像噪聲來源。一般根據(jù)所用頻率選擇提取微泡信號技術(shù)，而頻率則取決于成像深度。較高頻率下微泡諧振性差、散射諧波小，故基于微泡運動或破壞的技術(shù)更為可取。DL技術(shù)亦可用于分離微泡與組織[17]。非線性技術(shù)有利于接近共振，可采用脈沖反演和振幅調(diào)制方法提取微泡信號。

2.5 微泡分離 濾波步驟可用于識別每幀圖像中的孤立微泡[2]。圖像中來自不同微泡的回聲相互干擾，可致定位不準(zhǔn)確，在當(dāng)前階段或跟蹤階段應(yīng)予排斥，且每幀圖像僅能檢出有限數(shù)量的微泡，以免重疊。血液中微泡濃度相對較高時，可通過限制每幀檢出微泡數(shù)量而實現(xiàn)信號分離。DESAILLY等[11]以成對幀減實現(xiàn)超快成像幀速率，通過檢測微泡快速運動或破壞引起的連續(xù)超聲回波之間的去相關(guān)而隔離微泡。破壞微泡不僅限制微泡跟蹤能力，更不利于對微血管中流動微泡的可視化，故不可取。降低血液微泡濃度是實現(xiàn)孤立信號的最直接方法；通過輸注可保持微泡濃度恒定，以盡可能降低信號重疊。檢測和分離技術(shù)往往相互交織，以減少每幀可見微泡量。

2.6 定位 定位孤立信號是ULM技術(shù)的另一關(guān)鍵。超聲波在組織中傳播時具有相干性，一般由成像系統(tǒng)的PSF定義單個孤立的點散射體的響應(yīng)。微泡衍射受限圖像來源于單一的源，估計其位置時，允許精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過衍射極限。實際工作中，定位精度決定圖像分辨率的極限。定位顯微鏡技術(shù)通過限制每幀圖像中檢出的源的數(shù)量而避免其響應(yīng)相互干擾，以獲得遠(yuǎn)高于系統(tǒng)衍射極限分辨率的精度，于數(shù)千幀圖像上積累定位流動微泡，最終生成超分辨率血管結(jié)構(gòu)圖像。提取和分離組織中單個微泡時，微泡信號的信噪比對于定位算法的性能至關(guān)重要。選擇較大的微泡群有助于提高單個微泡的信噪比[18-19]。SONG等[20]以超快平面波成像解決人體超分辨率成像的潛在噪聲問題，豐富的時間和空間信息有利于分離微泡信號與背景噪聲。

2.7 跟蹤 通過微泡在兩幀圖像之間的位移可創(chuàng)建速度矢量，詳細(xì)的速度圖可顯示局部血管速度特征。跟蹤局部點可確定微血管中微泡的路徑和速度，極大提高圖像和信息質(zhì)量，并修改其解釋，其空間分辨率比多普勒更具優(yōu)勢，且在很大程度上與流動位移方向無關(guān)；其重要優(yōu)點之一是排除了人工微泡，僅保留具有相干路徑的微泡而形成噪聲較低的圖像。目前ULM技術(shù)創(chuàng)建圖像多已不再是簡單積累微泡的亞波長位置，可沿軌道各種定位其位移而實現(xiàn)插值。一些學(xué)者[3，13]嘗試以此建立每個微泡在微米尺度上的方向和速度?；诳柭?Kalman)濾波器跟蹤微泡能顯著提高跟蹤精度[21]。

2.8 可視化 運動校正后于微泡位置創(chuàng)建地圖能可視化定位、密度或計算速度，揭示血管網(wǎng)絡(luò)細(xì)節(jié)，可通過檢測反映超分辨率細(xì)節(jié)尺度的像素大小的細(xì)網(wǎng)格中積累的微泡或?qū)⒚看味ㄎ焕L制為高斯分布而實現(xiàn)，其值反映定位的不確定性。

3 USRmi用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

3.1 癌癥 超聲成像成本低且安全[22]，可作為癌癥的首選影像學(xué)檢查方式。乳腺癌現(xiàn)已成為最常見的癌癥[23]。GHOSH等[24]以USRmi縱向監(jiān)測小鼠三陰性乳腺癌微血管網(wǎng)絡(luò)變化，發(fā)現(xiàn)靶向治療后腫瘤組織的血管組織比逐漸下降，表明USRmi具有在體監(jiān)測早期腫瘤對藥物治療的反應(yīng)的潛力。

傳統(tǒng)灰階或多普勒超聲技術(shù)難以可視化早期腫瘤微血管結(jié)構(gòu)，而高分辨率對比超聲能檢出血管生成的生物標(biāo)志物[25-27]。2012年，GESSNER等[25]提出一種高分辨率超諧波成像技術(shù)，即聲學(xué)血管造影，能可視化腫瘤相關(guān)微血管異常，并檢測腫瘤引起的體內(nèi)血管生成相關(guān)形態(tài)異常，但其分辨率受限于成像系統(tǒng)頻率。ULM技術(shù)使USRmi成為潛在的強大工具，可通過血管生成標(biāo)記識別惡性腫瘤。LIN等[26]以USRmi觀察大鼠纖維肉瘤的三維微血管模式(圖2)，并與健康組織相對照，顯示腫瘤血管生成特征，如高度彎曲等，圖像空間分辨率相比傳統(tǒng)聲學(xué)血管造影大幅提升。

圖2[26] 應(yīng)用超分辨率成像三維微血管模式可視化大鼠纖維肉瘤的最大強度投影圖像，顯示健康微血管結(jié)構(gòu)(A、B)和腫瘤相關(guān)微血管(C、D)3D結(jié)構(gòu)

ULM用于臨床應(yīng)超越簡單描述微血管形態(tài)而允許提取相關(guān)生物標(biāo)志物。2018年，OPACIC等[27]提出運動模型超聲定位顯微鏡(motion model ultrasound localization microscopy, mULM)作為先進(jìn)跟蹤技術(shù)用于臨床，采用標(biāo)準(zhǔn)幀速率常規(guī)超聲設(shè)備可于不足1分鐘內(nèi)提取超分辨率圖像和新的參數(shù)，準(zhǔn)確識別不同血管表型腫瘤(圖3)；通過USRmi可導(dǎo)出其功能參數(shù)，包括相對血容量、血流方向、血流速度、血管距離和速度，并可區(qū)分不同類型腫瘤，有望成為診斷腫瘤和監(jiān)測治療不可或缺的工具。USRmi重建微血管網(wǎng)絡(luò)精細(xì)結(jié)構(gòu)可幫助診斷惡性腫瘤或區(qū)分不同類型腫瘤。

圖3[27] 基于mULM的不同血管表型腫瘤參數(shù)圖 彩色編碼地圖顯示微泡覆蓋檢測位置，示相對血容量(A)、單個微泡速度(B)和微泡血流方向(C)

3.2 神經(jīng)病學(xué) CT血管造影(CT angiography, CTA)和MR血管成像(MR angiography, MRA)為臨床常用腦血管成像方法，其血管解剖成像分辨率為毫米級，且對血流動力學(xué)不敏感。由于顱骨可致聲束明顯衰減和失真，超聲腦血管成像主要用于新生兒和開放顱骨腦手術(shù)[28]。超快超聲成像極大地提高了對腦血流的敏感性?；诔暡ǖ哪X功能成像以檢測腦血管容量變化替代腦活動，其誕生標(biāo)志著超聲醫(yī)學(xué)已進(jìn)入神經(jīng)成像領(lǐng)域。ERRICO等[3]于2015年以15 MHz超聲波探針穿過大鼠頭骨，采用超快超聲定位顯微鏡(ultrafast ultrasound localization microscopy, uULM)行大腦微血管成像(圖4)，其分辨率可用于9 μm(1/10λ)的血管，并以150 s掃描時長實現(xiàn)了平面內(nèi)血流剖面。2018年COUTURE等[29]通過定位孤立的小于20 μm微泡，跟蹤并積累微泡移動位置而生成超分辨率圖像，克服了空間分辨率的衍射極限。

圖4[3] 采用超速掃描儀通過頭骨骨質(zhì)稀疏部位行大鼠腦血管超分辨率圖像(15 MHz) A.于頭骨較薄處行冠狀位uULM，得到10 μm×8 μm的深度和橫向分辨率； B.來自A的部分血管的平面內(nèi)速度圖； C.經(jīng)完整頭骨行uULM，獲得12.5 μm×1 μm的深度和橫向分辨率，可檢出最小血管寬度為20 μm； D.來自C的部分血管的平面內(nèi)速度圖 (箭示血流方向)

迄今為止尚無任何在體、非侵入性成像技術(shù)可捕獲人腦毫米分辨率以下解剖和功能特征。相比之下，將USRmi動物模型成果向臨床轉(zhuǎn)化是更為緊迫的現(xiàn)實問題。2021年DEMENé等[30]靜脈注入微泡，以超快ULM行微米級分辨率經(jīng)顱深層成像，獲得人腦血管及相應(yīng)量化血流動力學(xué)參數(shù)，解決了經(jīng)顱ULM(transcranial ULM, t-ULM)空間分辨率低、顱骨畸變和運動偽影等主要問題，表明這種低超聲波頻率、預(yù)期低信噪比的技術(shù)不僅可在存在運動的情況下用于成人大腦，且分辨力可達(dá)25 μm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了功能超聲成像的1 mm分辨力；除顯示解剖結(jié)構(gòu)之外，還可表征動脈瘤的血流動力學(xué)(圖5)。USRmi在神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域具有巨大潛力，可極大提高對大腦的理解及對神經(jīng)疾病的監(jiān)測能力。

圖5[30] t-ULM顯示深部動脈瘤 A.右大腦中動脈瘤患者傾斜軸向腦切片ULM(獲得24 s)； B、C.與之對應(yīng)的6 mm(B)、7 mm層厚(C)CTA最大強度投影圖 (綠箭頭示右大腦中動脈瘤，藍(lán)箭頭示血管，白框示載瘤區(qū))

3.3 腎臟病學(xué) 2017年FOIRET等[31]將USRmi用于腎臟微血管，以專用高幀率成像序列定位大鼠腎臟內(nèi)單個微泡，通過假設(shè)剛性運動(翻譯和旋轉(zhuǎn))跟蹤器官運動并加以校正，同時跟蹤微泡以評估小血管血流速度，結(jié)果表明該技術(shù)具有改善血管表征的潛力。SONG等[20]在USRmi噪聲方面取得突破，超快成像的豐富時空信息支持分離微泡信號與背景噪聲，將非局部手段去噪濾波器用于微泡數(shù)據(jù)時空域，以保存微泡運動軌跡，并抑制隨機背景噪聲。CHEN等[32]應(yīng)用USRmi技術(shù)，以降至32 μm分辨力的成像模式成功識別腎臟微血管，于缺血-再灌注損傷腎臟觀察到腎纖維化，并發(fā)現(xiàn)腎臟大小、皮層厚度及相對血容量均與微血管密度顯著下降有關(guān)，提示這項技術(shù)可作為監(jiān)測進(jìn)行性腎病的有前途的診斷工具。ANDERSEN等[33]以改進(jìn)的臨床超聲儀獲得大鼠腎臟健康血管的高度詳細(xì)的超聲超分辨率圖像(圖6)，顯示不同大鼠微泡數(shù)量的變化，結(jié)果顯示該法可廣泛用于研究腎臟疾病。

圖6[33] 健康大鼠腎微血管的超分辨率圖像 A.致密皮層(CO)微血管網(wǎng)與外髓質(zhì)(OM)和內(nèi)髓質(zhì)(IM)的直小血管之間有明顯的區(qū)別，其向下延伸至乳頭(PA)； B.平均每幀檢測到117個微泡的圖像； C.平均每幀檢測到70個微泡的圖像； D.MR T1增強圖像

此外，USRmi已用于觀察2型糖尿病小鼠骨骼肌微血管[34]、兔淋巴結(jié)微血管[35]及兔眼部微血管[36]等，未來將用于動物所有器官，最后應(yīng)用于人體。不久的將來ULM會成為一種診斷模式，提供深部組織的微觀層面生物信息。

4 總結(jié)

過去10年中，USRmi主要通過ULM技術(shù)克服了超聲成像的衍射極限，并用于癌癥、腦及腎臟等領(lǐng)域研究，但其臨床轉(zhuǎn)化仍存在諸多障礙[1]，主要體現(xiàn)在血管流量、時間分辨率、信噪比及運動等方面的限制，以及缺乏金標(biāo)準(zhǔn)、探針幾何形狀、后處理算法、血管網(wǎng)絡(luò)及缺乏三維重建等。顯示血管結(jié)構(gòu)需要較長時間為其主要缺陷之一，且長時間掃描不可避免會因生理或外部運動導(dǎo)致圖像質(zhì)量顯著下降；注入微泡濃度是另一主要問題，系統(tǒng)地經(jīng)血管給藥使臨床很難真正控制靶區(qū)微泡濃度。DL或?qū)⒂兄诳朔鲜鎏魬?zhàn)，但尚需進(jìn)一步評估。相信不久新型超聲掃描儀將可映射整個器官的三維微血管，使診斷更加精確，并減輕操作者依賴性。