孝夢甦，朱慶莉，趙辰陽，李建初，呂 珂，馮海涼，劉玉琴，牛梓涵，羅焱文，姜玉新*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院超聲醫(yī)學科 協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，北京 100730；2.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院細胞資源中心，北京 100005)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer， TNBC)指雌激素受體(estrogen receptor， ER)、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2， HER2)均為陰性的乳腺癌，在乳腺癌中占比約為20%～30%。不同于其他亞型乳腺癌，TNBC侵襲力強、惡性度高、預后差、復發(fā)及轉(zhuǎn)移率高[1]，肺、腦及骨轉(zhuǎn)移率高，死亡率高，對傳統(tǒng)化學治療相對較不敏感[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)在TNBC中的表達程度明顯高于其他亞型乳腺癌；約80% TNBC高表達EGFR[3]，而其他亞型中僅10%表達EGFR[4]，使得EGFR成為近年診斷及治療TNBC的重要靶點之一[5-6]。本研究采用超聲造影(contrast enhanced ultrasound， CEUS)動態(tài)觀察小鼠TNBC模型不同階段TNBC病灶及新生血管發(fā)展情況，評價EGFR通路靶向藥物治療TNBC的效果。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 35只雌性非肥胖糖尿病及嚴重聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency， NOD-SCID)小鼠，4～5周齡，體質(zhì)量16～18 g，購自華阜康生物科技股份有限公司。EGFR通路抑制劑為司美替尼(Selleck公司)，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)選擇性抑制劑為GDC-0941(Selleck公司)，人乳腺癌細胞MDA-MB-231、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清由國家實驗細胞資源共享平臺中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心提供。

1.2 構建模型 于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中復蘇MDA-MB-231細胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每4～6天進行傳代；待70%～80% MDA-MB-231細胞匯合度狀態(tài)良好時收集細胞并計數(shù)，以1×107個細胞/只接種于5只小鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后33天處死小鼠，獲取腫瘤組織并研磨制成單細胞懸液，以0.9%生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1×108個/ml；以1×107個/只接種其余30只小鼠左臀部皮下，隨機分為靶向組及對照組各15只，并逐只編號。對靶向組于建模后第3、7、11及15天經(jīng)腹腔注射聯(lián)合藥物(20 nmol司美替尼及20 nmol GDC-0941)，每只0.1 ml；對照組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 CEUS 采用Mindray Zonare超聲診斷儀，線陣探頭，頻率18～30 MHz。分別于建模后第5、10、15及20天行超聲檢查，每次隨機檢查5只。由2名具有3年工作經(jīng)驗的超聲科醫(yī)師將凝膠墊置于小鼠腹部與超聲波探頭之間，以灰階超聲測量小鼠左臀部腫瘤體積，并觀察其內(nèi)部回聲；以CDFI評價并記錄病灶內(nèi)部及周邊血流信號；顯示病灶最大切面，調(diào)節(jié)圖像至最佳，切換進入諧波CEUS模式，采用聲諾維(Bracco)加入5 ml生理鹽水溶解，充分振蕩至乳白色，形成微氣泡混懸液，六氟化硫濃度45 μg/ml，以眶后靜脈團注法將0.05 ml造影劑注入小鼠體內(nèi)，儲存120 s CEUS圖像。根據(jù)增強達峰時病灶內(nèi)造影劑分布將增強模式分為4型[7]：Ⅰ型，周邊呈環(huán)狀增強，內(nèi)部無增強；Ⅱ型，周邊呈環(huán)狀增強，并向病灶內(nèi)穿入；Ⅲ型，呈均勻或不均勻的彌漫性增強；Ⅳ型，周邊呈環(huán)狀增強，病灶內(nèi)部呈結(jié)節(jié)狀增強，意見存在分歧時經(jīng)協(xié)商達成一致。以Philips SonoLiver軟件繪制時間-強度曲線(time-intensity curve， TIC)，計算CEUS相關參數(shù)，包括病灶峰值強度(peak intensity， PI)、達峰時間(time to peak， TTP)及上升時間(rise time， RT)；每名醫(yī)師測算3次，取平均值作為結(jié)果。

1.4 病理學 每次CEUS檢查后隨機處死每組3～4只小鼠(最后一日全部處死)，切取腫瘤組織，沿CEUS檢查切面剖開腫瘤，于切面?zhèn)葮擞浤[瘤方向，以10%多聚甲醛溶液固定標本。常規(guī)進行HE染色，以免疫組織化學檢測EGFR及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)表達水平；以3D Hishtech Pannoramic 250掃描儀及Image-pro pus 6.0軟件測量光密度(optical density， OD)值。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。以中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示不符合正態(tài)分布的計量資料，組間比較行Mann-WhitneyU檢驗；采用χ2檢驗或Fisher精確概率法比較組間CDFI及CEUS增強模式的差異。以Spearman相關性分析評價CEUS參數(shù)與病理學指標的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)超聲 成功建立30只TNBC小鼠模型，成瘤率100%。建模后第5天，靶向組與對照組腫瘤體積無明顯差異(P>0.05)；建模后第10～20天，靶向組腫瘤體積均明顯小于對照組(P均<0.05)，見表1。

表1 不同時間點小鼠TNBC模型腫瘤體積比較

常規(guī)超聲2組腫瘤均表現(xiàn)為邊界清晰的低回聲，內(nèi)部多較均勻。靶向組7只CDFI 未見血流信號，8只內(nèi)部或周邊見條形血流信號；對照組3只未見血流信號，12只內(nèi)部或周邊見條形血流信號。組間小鼠TNBC病灶 CDFI表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.245)。

2.2 CEUS 靶向組Ⅰ型增強1只、Ⅱ型4只、Ⅲ型1只，Ⅳ型9只；對照組Ⅰ型2只、Ⅱ型2只、Ⅲ型2只、Ⅳ型9只；組間小鼠TNBC病灶 CEUS增強模式差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.333，P=0.721)。

建模后第5～20天，靶向組小鼠TNBC病灶PI均顯著低于對照組(P均<0.05)；組間RT、TTP差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表2及圖1、2。

圖1 建模后第10天靶向組小鼠 A.灰階超聲可見邊界清晰的低回聲腫瘤； B.CDFI于腫瘤內(nèi)部未見明顯血流信號，周邊可見條形血流信號； C.CEUS可見腫瘤周邊呈環(huán)狀增強，并向病灶內(nèi)穿入(Ⅱ型)； D.TIC顯示PI為269%

圖2 建模后第10天對照組 A.灰階超聲可見邊界清晰的低回聲腫瘤； B.CDFI于腫瘤內(nèi)部未見明顯血流信號； C.CEUS可見腫瘤內(nèi)部呈不均勻彌漫性增強(Ⅲ型)； D.TIC顯示PI為8 440%

表2 不同時間點小鼠TNBC模型TNBC CEUS參數(shù)比較

2.3 病理學 建模后第10～20天，靶向組EGFR均顯著低于對照組(P均<0.05)；建模后第5～20天，靶向組VEGF均顯著低于對照組(P均<0.05)，見表3。

表3 不同時間點小鼠TNBC模型腫瘤EGFR及VEGF OD值比較

2.4 相關性分析 EGFR與VEGF具有相關性(r=0.629，P<0.001)；PI與EGFR及VEGF均具有相關性(r=0.679、0.839，P<0.001)；RT、TTP與EGFR及VEGF均無明顯相關(P均>0.05)。

3 討論

EGFR可促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[8-9]。TNBC缺失其他亞型乳腺癌所具有的ER和HER2介導的通路，而EGFR通路對于TNBC發(fā)病具有至關重要的作用，相比不表達EGFR者，EGFR高表達TNBC患者預后差、轉(zhuǎn)移率高、生存率低，治療效果差[3]。本研究采用EGFR通路靶向藥物阻斷EGFR信號傳導，以期達到靶向阻斷腫瘤生長和新生血管生成的效果。

本研究以超聲動態(tài)觀察TNBC腫瘤生長情況及靶向藥物治療后的生長變化情況，發(fā)現(xiàn)初期(建模后第5天)2組腫瘤未見明顯差異，而后期(建模后第10～20天)靶向組腫瘤體積明顯小于對照組，提示靶向藥物對腫瘤具有明顯抑制作用。LIAO等[10]應用攜帶藥物的納米復合物靶向結(jié)合TNBC的EGFR，以靶向阻斷EGFR通路，結(jié)果顯示其可顯著抑制腫瘤生長；而非TNBC低表達EGFR，EGFR靶向治療對其無明顯效果。上述研究及本研究結(jié)果均提示EGFR是治療TNBC的重要靶點。

乳腺癌是典型的血管依賴性腫瘤，新生血管對TNBC的發(fā)生發(fā)展具有至關重要的作用。EGFR可增強血管生成因子表達，促進血管內(nèi)皮細胞芽生、增殖。CEUS中將造影劑注入血管內(nèi)，既可清晰顯示腫瘤血管分布及走行，又能獲得腫瘤血管功能參數(shù)，定量評估腫瘤微循環(huán)灌注。本研究應用CEUS動態(tài)觀察不同階段TNBC的血供變化，發(fā)現(xiàn)隨時間延長，TNBC新生血管逐漸增多、PI逐漸增加；靶向阻斷EGFR通路后，PI顯著低于對照組；病理結(jié)果顯示，靶向組TNBC的EGFR與VEGF表達均顯著低于對照組。

本研究發(fā)現(xiàn)CEUS所測 PI與EGFR、VEGF均具有相關性，其變化趨勢一致；EGFR與VEGF亦相關。EGFR能刺激平滑肌細胞分泌VEGF，進一步促進腫瘤新生血管生成。EGFR介導的信號傳導在血管生成中具有重要作用，阻斷EGFR通路可有效降低VEGF表達，減少TNBC新生血管生成。

綜上所述， CEUS可動態(tài)評估小鼠TNBC病灶及血管生成，可視化及量化TNBC生長過程中新生血管的變化，為評估靶向治療TNBC效果提供影像學依據(jù)；靶向阻斷EGFR通路可有效縮小TNBC腫瘤體積、降低CEUS PI及EGFR、VEGF表達水平。本研究CEUS采用眶后靜脈注射法，小鼠較難耐受，導致各時間點小鼠樣本量較小，有待進一步完善。