陳雅蘭，曾卿，劉暢，廖登群，李先恩

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara 為百合科重樓屬陰生植物，主要分布在中國西南地區(qū)，如四川、福建、湖南[1]，以干燥后的塊莖入藥，味苦，性微寒，具有消腫止痛、清熱解毒的功效?，F(xiàn)代研究表明，七葉一枝花具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、止血抑菌[4]等作用，其有效成分主要為甾體類活性成分[5-6]，包括重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ等。近年來隨著市場需求擴大，重樓野生資源面臨枯竭，開展遮陰田[7-8]或林下[9]栽培成為解決資源問題的有效途徑之一。

光是影響植物生理狀態(tài)和生長的重要生態(tài)因子，光照不足或光照過強對植物生長品質(zhì)、物質(zhì)積累和經(jīng)濟性狀影響較大[10-12]。對于陰生植物，強光帶來的光抑制會影響凈光合速率、葉綠素含量和表觀量子效率，對植物的生長發(fā)育帶來極大的損害。七葉一枝花作為多年生陰生藥用植物，生長在潮濕的遮陰環(huán)境中（如山谷或林下）。多項研究表明，不同程度遮陰條件下的七葉一枝花具有不同的光合特性，總皂苷含量也存在一定的差異[13-16]。本研究設(shè)計2 種遮陰度以探討遮陰度對七葉一枝花生長過程中光合作用參數(shù)的影響。在采收時測定不同組織中主要皂苷類成分和可溶性糖的含量，比較不同遮陰度下不同組織中代謝物的差異，進而揭示七葉一枝花適宜光照條件，為人工栽培和引種馴化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

GFS-3000 型便攜式光合作用測定儀（上海澤泉科技股份有限公司）；UV 2550 型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；ACQUITY UHPLCCLASS 型超高效液相色譜系統(tǒng)-紫外檢測器、2695型高效液相色譜-2424 型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Waters 公司）；KQ 5200 DV 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XSE 205 Dual Range 型電子天平（上海生物工程有限公司）；DFT-100C 型100 g 手提式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京陸?？萍加邢薰荆?。

1.2 試藥

對照品D（+）-無水葡萄糖（批號：S10S9I69833）、蔗糖（批號：S02S6G1）、D-果糖（批號：J31M8R36916）、鼠李糖（批號：SA0411GA13）、重樓皂苷Ⅴ（批號：Y2508H46682）、纖細(xì)薯蕷皂苷（批號：HN1126XA14）、重樓皂苷H（批號：Y21A9H68360）均購于上海源葉生物科技有限公司；對照品重樓皂苷Ⅰ（批號：MUST-17021905）、重樓皂苷Ⅱ（批號：MUST-17021906）、重樓皂苷Ⅵ（批號：MUST-17052210）、重樓皂苷Ⅶ（批號：MUST-17052211）均購于成都曼思特生物科技有限公司；薯蕷皂苷對照品（批號：111707-201703）購于中國食品藥品檢定研究院，以上對照品純度均大于98%。

1.3 樣品

樣品為湖南省慈利縣七葉一枝花野生資源，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所李先恩研究員鑒定為七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara。2018 年秋季，將樣品移栽到北京藥用植物研究所試驗田的拱形遮陰棚中，株距40 cm、行距30 cm。拱形遮陰棚寬8 m、長30 m、高3 m，分為2 個地塊，95%遮陰覆蓋2 層黑色遮陽網(wǎng)，85%遮陰覆蓋1 層黑色遮陽網(wǎng)。

2 方法

2.1 光合色素含量測定

采用紫外-可見分光光度法測定光合色素含量。每個遮陰處理隨機選取6片長勢基本一致、健康的葉片，清理干凈后去除葉脈并剪成約0.3 mm×0.3 mm碎片。準(zhǔn)確稱取葉片0.1 g 至浸提液（丙酮-無水乙醇2∶1）15 mL 中，密封時用錫箔紙包裹至暗處，不定時搖勻，提取至組織灰白。以浸提液為空白，測定各浸提液在663、645、470 nm 下的吸光度（A），每個樣品重復(fù)測定3 次。光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算公式如下。

上式中，A663、A645、A470分別為663、645、470 nm下A，Ca、Cb分別為葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量濃度，V為提取液的體積，W為葉片鮮質(zhì)量。

2.2 光合生理指標(biāo)測定

2.2.1 光響應(yīng)曲線測定 于2018年7月中旬、晴天、北京時間14：00，采用便攜式光合作用測定儀測定光響應(yīng)曲線。測定時設(shè)置空氣流速為750 μmol·s-1，CO2濃度為0.04%，內(nèi)置光照強度（PPFD）梯度為0、20、

50、100、200、300、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000 μmol·m-2·s-1，每個光強下控制測定時間為2 min，5 次重復(fù)。將不同光照強度下的響應(yīng)值代入光和計算4.1.1 軟件內(nèi)，使用直角雙曲線修正模型進行計算[17]，得到光飽和點（LSP，μmol·m-2·s-1）、光補償點（LCP，μmol·m-2·s-1）及最大凈光合速率（Pnmax）。

2.2.2 光合日變化測定 于2020 年8 月初的晴天，選擇生長健康的植株3株，每株選擇高度一致的1枚葉片，于8：00—18：00，每隔2 h，采用便攜式光合測定儀測定光合參數(shù)，每片葉重復(fù)5 次。測定指標(biāo)為凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）及胞間CO2濃度（Ci）。

2.3 生長指標(biāo)測定

于2020 年10 月8 日選擇不同遮陰條件下七葉一枝花植株各12 株，連根挖起，用水小心沖洗根莖和根系泥土，保持根系完整，將植株分為往年生根莖、當(dāng)年生根莖、須根、莖、葉、花梗、萼片、果。用卷尺測定株高、莖長、花梗長、葉長、葉寬、萼片長、萼片寬等形態(tài)指標(biāo)。各部位稱取鮮質(zhì)量后于60 ℃烘干至恒重，稱定質(zhì)量。

2.4 重樓皂苷含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 七葉一枝花各部位烘干樣品打粉，過四號篩。精密稱取往年生根莖、當(dāng)年生根莖、須根、莖、葉樣品約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入95%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補足減失質(zhì)量，藥液抽濾后過0.22 μm 微孔濾膜，即得。每個樣品設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷對照品，甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.37、0.32、0.41、0.44、0.29、0.28、0.42、0.31 mg·mL-1的混合對照品，進樣前稀釋至適宜質(zhì)量濃度。

2.4.3 色譜條件 色譜柱為UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～6 min，73%～70%A；6～9 min，70%～63%A；9～28 min，63%～48%A）；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量3 μL；檢測波長203 nm。

2.5 重樓糖含量測定

2.5.1 供試品溶液的制備 精密稱取往年生根莖、當(dāng)年生根莖、須根、莖、葉樣品約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補足減失質(zhì)量，藥液抽濾后過0.22 μm 微孔濾膜，即得。每個樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

2.5.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取適量鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖對照品，10%乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為3.07、8.07、7.20、4.33 mg·mL-1的混合對照品溶液，進樣前稀釋至適宜質(zhì)量濃度。

2.5.3 色譜條件 色譜柱為HPLC XBridge Amide（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相為0.1%三乙胺水溶液（A）-乙腈（B），等度洗脫（27∶73）；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量5 μL；增益100；氣體壓力275.8 kPa；漂移管溫度68 ℃。

2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Office 2019、GraphPad 7.0 和SPSS 26.0 對數(shù)據(jù)進行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 光合色素含量測定

在高等植物當(dāng)中，光合色素分為葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素，光合色素在光合作用中參與光能的吸收與傳遞，引起原初光化學(xué)反應(yīng)。作為集光復(fù)合體[18]，較高水平的葉綠素可以提高植物的光捕捉能力，從而在較低的光強下保持較高的光合效率。2種遮陰條件下，七葉一枝花葉片葉綠素a和葉綠素b 質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。七葉一枝花葉片在85%和95%遮陰條件下，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（4.991±0.695）、（7.089±0.557）mg·g-1，葉綠素b 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.709±0.369）、（4.117±0.339）mg·g-1，類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（0.693±0.060）、（0.724±0.470）mg·g-1。其 中，遮陰強弱對葉綠素a、葉綠素b 均有影響，95%遮陰下葉綠素a和葉綠素b的含量明顯高于85%遮陰。類胡蘿卜素的含量在2 種遮陰條件下差異無統(tǒng)計學(xué)意義。葉綠素a 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/葉綠素b 質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評價植物利用弱光能力的值，在2 種遮陰條件下，七葉一枝花的葉綠素a 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/葉綠素b 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.842±0.056、1.722±0.010，差 異無統(tǒng) 計 學(xué)意義，表明本研究中七葉一枝花植株具有相似的弱光捕獲能力。

3.2 不同遮陰條件下的光合特性

3.2.1 光響應(yīng)曲線的比較 使用直角雙曲線修正模型對85%和95%遮陰條件下葉片的光合數(shù)據(jù)進行擬合，得到光響應(yīng)曲線（圖1），同時得到擬合后的光合參數(shù)。在85%遮陰條件下七葉一枝花葉片 的Pnmax為（3.408±0.256）μmol·m-2·s-1，95%遮陰條件下為（3.749±0.067）μmol·m-2·s-1，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對比2種遮陰條件下的光飽和點發(fā)現(xiàn)，85% 遮陰條件下葉片光飽和點達到（626.131±43.534）μmol·m-2·s-1，95%遮陰條件下葉片的光飽和點為（473.915±22.102）μmol·m-2·s-1，說明95%遮陰能夠改善葉片受到的光抑制現(xiàn)象。

圖1 2種遮陰條件下七葉一枝花葉片光響應(yīng)曲線（, n=5）

3.2.2 光合日變化曲線 2 種遮陰條件下七葉一枝花的光合參數(shù)日變化曲線如圖2 所示。Pn作為衡量光合能力的重要參數(shù)，在85%遮陰條件下光合日變化曲線呈現(xiàn)“單峰型”，12：00 達到當(dāng)天Pn的最大值1.932 μmol·m-2·s-1，隨后Pn降低；在95%遮陰條件下Pn變化趨勢呈“雙峰型”，12：00 和16：00達到峰值，分別為1.119、0.886 μmol·m-2·s-1。

Ci日變化曲線與Pn日變化曲線為軸對稱，因此Ci和Pn之間呈負(fù)相關(guān)。85%遮陰條件下Ci在12：00最低，然后隨時間緩慢增加；95%遮陰下Ci變化呈“W”形，即在8：00—14：00 先下降后上升，隨后在16：00 達到一天中的最低值，而后開始回升。

由圖2可以看出，2種遮陰環(huán)境下七葉一枝花在一天當(dāng)中葉片蒸騰的強弱。85%遮陰和95%遮陰條件下葉片的E均為單峰型，即在14：00達到最大值，分別為1.812、2.079 mmol·m-2·s-1，隨后E逐漸下降。七葉一枝花在2種遮陰條件下的Gs都呈現(xiàn)出緩慢升高-逐漸降低的變化趨勢，在8：00—12：00均處在緩慢升高的階段，12：00 達到一天中的最大值，分別為38.760、46.340 μmol·m-2·s-1，隨后Gs逐漸下降。

圖2 2種遮陰條件下七葉一枝花葉片光合參數(shù)日變化曲線（, n=5）

3.3 不同遮陰條件下的生長指標(biāo)比較

遮陰顯著影響株高等植物形態(tài)性狀[14]。如圖3所示，除萼片大小無明顯差別外，2 個遮光度之間存在明顯的形態(tài)差異。總體而言，95%遮陰條件下的株高、莖長、花梗長、葉長和葉寬均明顯高于85%遮陰。這些結(jié)果表明，當(dāng)光照強度降低時，莖、花梗和葉片形態(tài)會增大，以提高光能的利用率。

圖3 七葉一枝花2種遮陰條件下形態(tài)指標(biāo)（, n=12）

3.4 不同遮陰條件下的重樓皂苷含量

3.4.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.4.1.1 線性關(guān)系 精密移取2.4.2 項下的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷儲備液，2 倍稀釋法配成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.4.3 項下條件分別測定，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 七葉一枝花中8種皂苷含量測定線性考察結(jié)果

3.4.1.2 精密度試驗 精密吸取2.4.2 項下對照品溶液3 μL，按2.4.3 項下條件連續(xù)進樣6 次，測定重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷色譜峰峰面積，計算各峰面積的RSD，考察儀器的精密度，RSD 為0.29%～1.81%，表明儀器精密度良好。

3.4.1.3 重復(fù)性試驗 取七葉一枝花往年生根莖樣品6 份，按2.4.1 項方法制備供試品溶液，按2.4.3項下條件測定，記錄峰面積，計算各成分含量的RSD，RSD 為0.65%～2.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.1.4 穩(wěn)定性試驗 取七葉一枝花往年生根莖供試品溶液，按2.4.3 項下條件，分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h 進行測定，記錄峰面積，計算各峰面積的RSD，RSD 為0.80%～3.79%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.2 含量測定 甾體皂苷是七葉一枝花的主要次生代謝產(chǎn)物，其含量的高低影響藥材的質(zhì)量。洪春桃等[15]研究發(fā)現(xiàn)，遮陰一定程度可以促進七葉一枝花根莖中皂苷的積累，而過度遮陰（90%）會降低總皂苷含量。七葉一枝花在2 種遮陰條件下不同部位的皂苷含量經(jīng)過雙因素方差分析（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遮陰條件和不同部位的交互作用對重樓皂苷H含量的影響極其顯著。除重樓皂苷Ⅵ外，其余皂苷均可在七葉一枝花不同部位中檢出。

表2 2種遮陰條件下七葉一枝花不同部位的皂苷含量雙因素方差分析結(jié)果

如圖4 所示，在95%遮陰條件下，七葉一枝花往年生根莖中除重樓皂苷Ⅴ，其余6 種皂苷含量均明顯低于85%遮陰條件下的七葉一枝花。在當(dāng)年生根莖中，除95%遮陰條件下重樓皂苷Ⅱ略高于85%遮陰，薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷H 含量均隨著遮陰程度增加而降低。須根中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ隨遮陰增加含量下降。與根莖、須根和葉相比，采收期莖中積累的皂苷量較少。與85%遮陰相比，95%遮陰只降低了七葉一枝花莖中纖細(xì)薯蕷皂苷的含量。薯蕷皂苷和纖細(xì)薯蕷皂苷在七葉一枝花成熟葉片中大量積累，所有部位重樓皂苷Ⅴ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于0.02%。

圖4 2種遮陰條件下七葉一枝花不同部位的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（, n=3）

3.5 不同遮陰條件下的重樓糖含量

3.5.1 方法學(xué)考察 線性考察結(jié)果如表3 所示，重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性結(jié)果RSD均小于5%，表明方法良好。

表3 七葉一枝花中糖含量測定方法學(xué)考察結(jié)果

3.5.2 糖含量分析 85%和95%遮陰條件下七葉一枝花的不同部位糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖5所示。通過方差分析和多重比較的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種遮陰條件下，5 個部位中的葡萄糖含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。僅在莖和葉片中檢出果糖和鼠李糖，且在2種遮陰下差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同遮陰度對往年生根、當(dāng)年生根以及須根當(dāng)中的蔗糖含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），95%遮陰條件下根部含量較高，莖中的蔗糖含量以85%遮陰下最高，而葉中的蔗糖含量以95%遮陰下最高。

圖5 2種遮陰條件七葉一枝花不同部位可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（, n=5）

4 討論

與許多陰生植物一樣，七葉一枝花對光照非常敏感，在一定的低散射光強范圍內(nèi)生長較好。眾所周知，光合作用在調(diào)節(jié)植物生長和干物質(zhì)積累方面起著重要作用，并受到環(huán)境光、濕度和溫度的影響。Pn不僅反映了植物的光合能力，還與光合產(chǎn)物的積累有關(guān)[19-20]。本研究中，2 種遮陰條件下光合參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但總體來說，85%遮光條件下Pn高于95%遮陰條件（圖1），光合日變化也是相同的趨勢（圖2）。洪春桃等[15]研究發(fā)現(xiàn)，浙江省生長的七葉一枝花的Pn和葉綠素含量與株高呈正相關(guān)，70%遮陰條件下植株在苗期的Pn和株高均高于90%遮陰條件下的植株，但葉綠素含量較低。在本研究中，85%遮陰條件下植株比95%遮陰條件下的Pn更高，收獲期株高、葉片長寬和葉綠素含量更低，提示葉片可以通過增加葉面積和光合色素來提高光能的利用率以及散射光的效率。筆者也觀察到，在95%遮陰條件下，植株從苗期開始葉色就更暗，這說明弱光逆轉(zhuǎn)了長日照環(huán)境下植物的光合作用和生長，導(dǎo)致衰老延遲[21-22]。蔗糖是植物組織間主要的光合產(chǎn)物和固定碳的轉(zhuǎn)運體[23-24]。在95%遮陰條件下，七葉一枝花葉片和當(dāng)年生根莖的蔗糖含量高于85%遮陰條件下，更有利于根部有機物質(zhì)的累積。

皂苷類化合物是七葉一枝花的主要活性成分，隨著光照強度的降低，各部位含量均有下降。七葉一枝花和云南重樓植株中皂苷的積累受光強影響較大，在一定的低光強度范圍內(nèi)，皂苷的積累會增加[15,25]。大量研究表明，植物生長和代謝產(chǎn)物積累受到光因子的調(diào)控，光因子包括光的強度和光的持續(xù)時間[26-27]?；钚曰衔锏暮渴侵饕馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。因此，通過栽培藥用植物獲得高產(chǎn)量和高經(jīng)濟效益的同時，更需要注重藥材品質(zhì)的提升和活性產(chǎn)物的累積。

七葉一枝花是一種重要的陰生藥用植物，具有較高的藥用效果和經(jīng)濟價值，目前在模擬陰生條件下進行人工栽培。田間遮陰試驗結(jié)果表明，95%遮陰有利于植株的生物量積累，85%遮陰有利于植株的光合作用和皂苷積累。本研究結(jié)果為栽培實踐中七葉一枝花的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，為優(yōu)化栽培方法以獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)藥材提供參考。