劉美娟，鄭司浩，趙莎，秦義杰，曾燕，王繼永

中國(guó)中藥有限公司，北京 100195

黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 為唇形科黃芩屬多年生草本植物，是一種廣泛使用的大宗藥材，其以根入藥，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1-3]。黃芩產(chǎn)于河北、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、山東、山西、陜西等地，不同產(chǎn)地黃芩藥材的藥效差異較大[4-5]。近年來(lái)，對(duì)黃芩的研究多集中在生理生化、藥理等方面[6-7]，不同種質(zhì)鑒別多運(yùn)用性狀鑒別及顯微鑒別等方法[8]，通常依賴于個(gè)人經(jīng)驗(yàn)及主觀判斷，技術(shù)可推廣性欠缺。黃芩產(chǎn)地的鑒別一直是黃芩物種鑒定的技術(shù)難點(diǎn)，也是當(dāng)前中藥資源產(chǎn)業(yè)面臨的行業(yè)難題。

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9]，已廣泛應(yīng)用于植物品種真實(shí)性鑒定及純度檢測(cè)研究[10-11]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記。由于SSR 分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳共顯性、譜帶擴(kuò)增穩(wěn)定、精度高、檢測(cè)時(shí)間短、技術(shù)成熟等特點(diǎn)，已應(yīng)用于作物遺傳學(xué)研究[12-13]。文苗苗等[14]對(duì)6 個(gè)野生或栽培產(chǎn)區(qū)共147 份黃芩種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析和評(píng)價(jià)，分子聚類結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)黃芩種質(zhì)間存在一定的遺傳分化和基因交流，遺傳變異主要存在于產(chǎn)區(qū)內(nèi)。張紅瑞等[15]利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)分析得到，黃芩種源間的親緣關(guān)系與地理位置存在一定的聯(lián)系。本研究基于黃芩全基因組設(shè)計(jì)SSR 引物，鑒別河北、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、山東、山西和陜西地區(qū)黃芩種質(zhì)資源，以期為黃芩產(chǎn)區(qū)鑒定、資源的保護(hù)和開發(fā)及分子標(biāo)記輔助育種等提供參考。

1 材料

黃芩樣本分別采于河北，遼寧、吉林（以下簡(jiǎn)稱“東北”），內(nèi)蒙古，山東，山西、陜西（以下簡(jiǎn)稱“山陜”）地區(qū)共計(jì)5 個(gè)產(chǎn)區(qū)的黃芩各12、12、10、11、13 株，所采樣品均為當(dāng)年萌發(fā)的鮮葉，樣品信息見表1。經(jīng)中國(guó)中藥有限公司曾燕副研究員鑒定為黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi。

表1 黃芩樣品采集信息

T100 型PCR 儀、GelDocXR+型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；DYY-6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；1-14 型離心機(jī)（德國(guó)Sartorius 公司）；NanoDrop One 型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）。

異丙醇（批號(hào)：20190605）、無(wú)水乙醇（批號(hào)：20190507）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TaqDNA聚合酶（批號(hào)：W9205a）、10×TaqBuffer（批號(hào)：U8402a）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取

黃芩基因組DNA 利用改良的十六烷基三甲基溴化銨法（mCTAB）提取。取黃芩葉片樣品100 mg，浸入液氮冷凍研磨至細(xì)小的粉末；加入buffer A溶液1.5 mL，反復(fù)顛倒混勻，冰浴10 min，10 000×g離心2 min，棄上清液；加入buffer A 溶液1.5 mL，反復(fù)顛倒混勻，冰浴10 min，10 000×g離心2 min 后，棄上清液；加入預(yù)熱的2%CTAB溶液800 μL，沉淀均質(zhì)懸浮后，65 ℃水浴1.5～2.0 h，其間顛倒均質(zhì)溶液3～5次；10 000×g室溫離心5 min，取DNA上清液至2.0 mL離心管中，加入等體積CI（三氯甲烷-異戊醇24∶1）溶液，顛倒搖床上混合10 min；10 000×g離心5 min，取上清液至新的2.0 mL 離心管中，加入等體積CI溶液，顛倒搖床上混合10 min；10 000×g離心10 min，取上清液至新的1.5 mL 離心管中，加0.6倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混合后置于-20 ℃冰箱保存1 h以上；10 000×g離心2 min，棄上清液，控干液滴，加入RNase溶液（100 mg·L-1）100 μL，37 ℃保存0.5 h；依次加入雙蒸水（ddH2O）150 μL、5 mol·L-1NaCl 50 μL和無(wú)水乙醇700 μL，充分混合，10 000×g離心3 min，控干液滴，加入70%乙醇600 μL，混合后離心2 min，棄上清液；加入70%乙醇600 μL，混合后離心2 min，棄上清液；加TE 緩沖液100 μL溶解DNA，并根據(jù)超微分光光度計(jì)測(cè)定將樣品DNA稀釋至50 ng·μL-1，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

2.2 SSR引物篩選

基于文獻(xiàn)研究篩選SSR 引物[16]：在SSR 核心區(qū)側(cè)翼序列中（150 bp 范圍），使用primer 3 進(jìn)行primer 引物設(shè)計(jì)。引物最佳長(zhǎng)度為24 bp；引物最小長(zhǎng)度為20 bp；引物最大長(zhǎng)度為28 bp；最佳退火溫度為58 ℃；最低退火溫度為55 ℃；最高退火溫度為60 ℃；1 對(duì)引物退火溫度的最大差值為1 ℃。其他參數(shù)采用primer 3 的默認(rèn)參數(shù)。將得到的引物BLAST 比對(duì)回基因組上，將成對(duì)引物在基因組上可以擴(kuò)增得到的序列長(zhǎng)度進(jìn)行比較，與含有目標(biāo)SSR的產(chǎn)物長(zhǎng)度差在2 kb 以上，保留該對(duì)引物，與含SSR 產(chǎn)物長(zhǎng)度差在2 kb 以內(nèi)的，濾掉該引物，最終得到59 233對(duì)SSR引物。選擇重復(fù)單元堿基數(shù)2～5 bp，重復(fù)單元5～10次的50對(duì)SSR引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，所選擇的引物長(zhǎng)度為20～25 bp，理論退火溫度為55～60 ℃，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為150～350 bp。

2.3 PCR擴(kuò)增及檢驗(yàn)

用篩選出的引物對(duì)提取的5 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)所有黃芩DNA 樣本進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為ddH2O 11.8 μL、10×TaqBuffer 2 μL、2 mmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2 μL、5 μmol·L-1正向引物（forward primer）1 μL、5 μmol·L-1反 向 引 物（reverse primer）1 μL、TaqDNA 聚合酶（TaqDNA polymerase）0.2 μL、50 ng·μL-1的DNA 模板2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性0.5 min，退火0.5 min（引物Sb2、Sb5、Sb13、Sb21、Sb23、Sb26、Sb28 退火溫度為55 ℃，引物Sb16、Sb22退火溫度為54 ℃），72 ℃延伸1 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

分別取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓160 V，時(shí)間15 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察否有條帶且片段大小是否合適以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)成功。將檢驗(yàn)成功的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序分型，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分型結(jié)果。

2.4 數(shù)據(jù)分析

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分型結(jié)果用GeneMarker 4.0 進(jìn)行峰圖判讀[17]。記錄等位基因片段大小，得到等位基因矩陣，具體是以“0，1”二元方式來(lái)記錄等位基因片段大小，即某個(gè)等位基因存在時(shí)記為1，某個(gè)等位基因不存在時(shí)記0，缺失數(shù)據(jù)記為-9，從而得到等位基因矩陣。根據(jù)上述等位基因矩陣，通過(guò)GenALEx 計(jì)算黃芩在每個(gè)產(chǎn)區(qū)間、每個(gè)個(gè)體間的遺傳多樣性數(shù)據(jù)及遺傳距離?；贕enALEx 計(jì)算所得的個(gè)體遺傳距離矩陣，通過(guò)分子進(jìn)化遺傳分析（MEGA）進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析，構(gòu)建聚類樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物篩選

SSR 是共顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增不同產(chǎn)區(qū)黃芩，擴(kuò)增產(chǎn)物牽引率相同的條帶被認(rèn)為是有同源性[18]。從擴(kuò)增成功率以及多態(tài)性（毛細(xì)管熒光電泳方式）2個(gè)維度進(jìn)行引物的選擇，最終選定9對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增成功率高的SSR 引物。篩選引物信息見表2，其中Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26 引物對(duì)東北地區(qū)黃芩擴(kuò)增成功率高；Sb21、Sb22、Sb28 引物對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)黃芩擴(kuò)增成功率高；Sb5、Sb13、Sb16、Sb22引物對(duì)山陜地區(qū)黃芩擴(kuò)增成功率高。

表2 黃芩DNA樣品PCR擴(kuò)增篩選引物信息

3.2 不同產(chǎn)區(qū)黃芩遺傳多樣性分析

3.2.1 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26 的遺傳多樣性分析 多態(tài)性位點(diǎn)是衡量遺傳多樣性的重要參數(shù)?；邳S芩SSR 引物組合（Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26）對(duì)5 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩遺傳多樣性進(jìn)行分析，見表3。結(jié)果顯示，5 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為3.200～4.600，有效等位基因數(shù)（Ne）為2.704～3.189，Shannon′s 指數(shù)（I）普遍較高，為0.994～1.197，其中東北產(chǎn)區(qū)的Ne均值相對(duì)最低，相應(yīng)的I也較低。同時(shí)山陜產(chǎn)區(qū)的樣品觀測(cè)雜合度（Ho）<期望雜合度（He），表明該產(chǎn)區(qū)可能存在一定的近交現(xiàn)象或者有雜合缺失未檢測(cè)到的情況。

表3 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的黃芩遺傳多樣性分析

3.2.2 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的遺傳多樣性分析 基于黃芩SSR 引物組合（Sb21、Sb22、Sb28）對(duì)5 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩遺傳多樣性進(jìn)行分析，見表4。5 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的Ne為1.592～4.091，I除了內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)外普遍較高，為0.545～1.461，其中內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)的Ne均值最低，相應(yīng)的I也較低。河北、內(nèi)蒙古、山東產(chǎn)區(qū)樣品的Ho>He，表明該產(chǎn)區(qū)可能存在一定的雜種選擇現(xiàn)象或者遠(yuǎn)交現(xiàn)象；東北產(chǎn)區(qū)與山陜產(chǎn)區(qū)樣品的Ho

表4 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的黃芩遺傳多樣性分析

3.2.3 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22 的遺傳多樣性分析 基于黃芩SSR 引物組合（Sb5、Sb13、Sb16、Sb22）對(duì)5 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩遺傳多樣性進(jìn)行分析，見表5。5個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的Ne為2.809～4.209，I普遍較高，為1.127～1.537，其中山陜產(chǎn)區(qū)的黃芩樣品Ne均值最低，相應(yīng)的I也較低。河北產(chǎn)區(qū)的樣品Ho

表5 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的黃芩遺傳多樣性分析

3.3 聚類結(jié)果分析

3.3.1 東北產(chǎn)區(qū)黃芩鑒定 基于黃芩SSR引物組合（Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26），通過(guò)GenALEx計(jì)算各產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的遺傳距離（表6）。各產(chǎn)區(qū)樣品間平均遺傳距離為0.296，其中東北與山東產(chǎn)區(qū)樣品的遺傳距離最大，為0.497，說(shuō)明2 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩種群關(guān)系最遠(yuǎn)；山東與河北產(chǎn)區(qū)樣品的遺傳距離最小，為0.192，說(shuō)明2 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩種群關(guān)系最近。通過(guò)MEGA進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類樹（圖1）。黃芩樣品聚為5 個(gè)分支，只有東北產(chǎn)區(qū)的聚為較純的1 個(gè)分支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時(shí)也說(shuō)明5 對(duì)SSR 引物可以較好地對(duì)產(chǎn)地為遼寧和吉林的黃芩樣品進(jìn)行區(qū)分鑒定。

表6 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的各產(chǎn)區(qū)黃芩樣品遺傳距離

圖1 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的不同產(chǎn)區(qū)黃芩遺傳聚類

3.3.2 內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)黃芩鑒定 基于黃芩SSR引物組合（Sb21、Sb22、Sb28），通過(guò)GenALEx 計(jì)算各產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的遺傳距離（表7）。各產(chǎn)區(qū)樣品間平均遺傳距離為0.255，其中山陜與內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)樣品的遺傳距離最大，為0.412，說(shuō)明2 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩的種群關(guān)系最遠(yuǎn)；山東與河北、山陜產(chǎn)區(qū)樣品的遺傳距離相對(duì)最小，分別為0.099、0.083，說(shuō)明山東與河北、山陜產(chǎn)區(qū)黃芩種群關(guān)系相對(duì)更近。通過(guò)MEGA進(jìn)行UPGMA 聚類分析，構(gòu)建聚類樹（圖2）。只有內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)的黃芩樣品聚為較純的1 支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時(shí)也說(shuō)明3 對(duì)SSR 引物可以較好地對(duì)產(chǎn)地為內(nèi)蒙古的黃芩進(jìn)行區(qū)分鑒定。

表7 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的各產(chǎn)區(qū)黃芩樣品遺傳距離

3.3.3 山陜產(chǎn)區(qū)黃芩鑒定 基于黃芩SSR引物組合（Sb5、Sb13、Sb16、Sb22），通過(guò)GenALEx 計(jì)算各產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的遺傳距離（表8）。各產(chǎn)區(qū)樣品間平均遺傳距離為0.356，其中山陜與東北產(chǎn)區(qū)樣品的遺傳距離最大，為0.565，說(shuō)明2 個(gè)產(chǎn)區(qū)黃芩的種群關(guān)系最遠(yuǎn)；產(chǎn)區(qū)河北與產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙古、東北的遺傳距離相對(duì)最小，分別為0.109、0.196，說(shuō)明產(chǎn)區(qū)河北與產(chǎn)區(qū)東北、內(nèi)蒙古的種群關(guān)系相對(duì)更近?；贕enALEx 計(jì)算所得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)中的遺傳距離，通過(guò)MEGA 進(jìn)行UPGMA 聚類分析，構(gòu)建聚類樹，如圖3 所示。只有山陜產(chǎn)區(qū)的聚為較純的一支，其他分支都有不同程度的混雜情況，同時(shí)也說(shuō)明4對(duì)SSR 引物可以較好地對(duì)山西、陜西產(chǎn)區(qū)的黃芩進(jìn)行區(qū)分鑒定。根據(jù)4對(duì)SSR引物多態(tài)位點(diǎn)結(jié)果，基于遺傳距離，若待鑒別黃芩與山陜產(chǎn)區(qū)聚在一起則表示該黃芩產(chǎn)地為山西或陜西。

表8 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的各產(chǎn)區(qū)黃芩樣品遺傳距離

圖3 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的不同產(chǎn)區(qū)黃芩遺傳聚類

4 討論

SSR 分子標(biāo)記在親緣關(guān)系鑒定、遺傳進(jìn)化關(guān)系、指紋圖譜、育種等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[19-23]。因此，可以利用分子標(biāo)記方法區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)黃芩資源，并鑒定黃芩親緣關(guān)系。本研究利用SSR分子標(biāo)記的方法，篩選出9 對(duì)引物，針對(duì)河北、東北（遼寧、吉林）、內(nèi)蒙古、山東、山陜（山西和陜西）地區(qū)共計(jì)5 個(gè)產(chǎn)區(qū)的黃芩進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的黃芩具有豐富的遺傳多樣性，這與齊琳潔等[24]研究結(jié)果一致，為黃芩種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與利用提供了依據(jù)。張紅瑞等[15]采用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)54個(gè)黃芩種源進(jìn)行分析。聚類分析圖自然聚為3 類，且地域相近的種源首先聚為一類，也存在陜西佳縣種源和遼寧建昌種源聚為一類，但不同的標(biāo)記得到的結(jié)果可能有差異。本研究對(duì)不同產(chǎn)區(qū)黃芩進(jìn)行SSR 分子標(biāo)記鑒別，得到3 個(gè)引物組合用于鑒別東北、內(nèi)蒙古、山陜產(chǎn)區(qū)的黃芩。而河北和山東產(chǎn)區(qū)的黃芩種質(zhì)由于混雜較為嚴(yán)重，目前無(wú)法根據(jù)產(chǎn)地將其區(qū)分開，這一研究結(jié)果與文苗苗等[14]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果可為黃芩優(yōu)勢(shì)種植資源收集、保存與評(píng)價(jià)提供參考。