姚 虹，宋賢響

江蘇省徐州市兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221006

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)正在逐漸受到關注，特別是兒童ITP，有研究報道，兒童ITP的發(fā)病率為1.9/10萬～6.4/10萬[1]。ITP的臨床表現(xiàn)以皮膚黏膜出血為主，伴隨著血小板數(shù)目異常減少和出血時間明顯延長等。兒童ITP的預后較成人ITP的預后好，但仍有10%左右的患兒臨床轉歸不佳，需長期使用激素等治療，嚴重影響患者的生活。目前，對于該病的機制研究主要集中在免疫介導的血小板異常[2]。體液免疫介導的抗血小板抗體生成和細胞免疫介導的T淋巴細胞相關細胞因子的水平紊亂在ITP的發(fā)病中起到關鍵作用[3]。維生素D3主要參與鈣磷代謝的調節(jié)，其在肝臟代謝為25-羥維生素D3[25(OH)D3]，隨后在腎臟代謝為1,25-羥維生素D3[1,25(OH)2D3]，進而具有生物學活性并發(fā)揮作用[4]。有研究提示，有活性的維生素D3能夠通過其受體對淋巴細胞等免疫細胞進行效應調節(jié)，進而影響機體的T淋巴細胞相關細胞因子水平[5-6]。但是目前關于25(OH)D3與ITP患兒T淋巴細胞相關細胞因子水平間關系的研究較少，本研究通過測定患兒和健康兒童25(OH)D3和T淋巴細胞相關細胞因子水平，旨在探討維生素D3在ITP發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床的治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年8月至2019年9月于本院就診的ITP患兒共127例納入研究作為患兒組，患兒均符合《兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療建議》中原發(fā)性ITP的診斷標準[7]。排除標準：(1)合并其他疾病，如再生障礙性貧血和白血病等；(2)ITP復發(fā)或者慢性ITP患兒；(3)近1個月內使用過相關藥物治療，如維生素D3和糖皮質激素等?；純航M男75例、女52例，年齡1～9歲、平均(4.0±1.2)歲。同時，根據(jù)血清25(OH)D3水平，將127例患兒分為缺乏組(低于30 nmol/L)、降低組(30～50 nmol/L)和正常組(高于50 nmol/L)。另外，將60例于本院門診體檢的健康兒童納入研究作為對照組，男35例、女25例，年齡1～9歲、平均(4.0±1.1)歲。納入研究的所有患兒及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準通過。

1.2方法

1.2.1患兒的治療 以1 g/(kg·d)注射人免疫球蛋白，連用2 d；以2 mg/(kg·d)口服潑尼松，連用4～6周，如果患兒不能耐受，可以換用甲潑尼龍，以1.6 mg/(kg·d)進行注射，療程不變。在治療過程中，應隨時關注患兒血小板和皮膚黏膜的出血情況，以便及時作出調整。血小板和出血情況未得到明顯改善者，使用地塞米松沖擊治療，0.6 mg/(kg·d)，連用4 d，每月1次，連用4個月[7-8]。觀察患兒治療4個月后的轉歸情況。

1.2.2標本采集與處理 對所有納入研究的兒童進行血清標本采集。于清晨空腹采集外周血4 mL，室溫放置20 min，使用3 000 r/min的離心機進行離心，取上層血清于—70 ℃冰箱凍存待用。ITP患兒分別于治療前和治療4個月后進行標本采集。

1.2.3各項指標的檢測 輔助性T淋巴細胞(Th)細胞因子使用美國BD公司的BD FACSantoⅡ流式細胞儀進行檢測。采用青島瑞斯凱爾公司生產的12項細胞因子檢測試劑盒及多重微球流式免疫熒光發(fā)光法進行白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的檢測。采用羅氏Cobas E602型全自動電化學發(fā)光分析儀和配套試劑盒進行25(OH)D3的檢測。

1.2.4療效判定標準 有效：經(jīng)過治療后，患兒的血小板計數(shù)>30×109/L，至少比基礎血小板計數(shù)增加2倍且沒有出血表現(xiàn)。無效：經(jīng)過治療后，患兒的血小板計數(shù)<30×109/L或血小板計數(shù)增加值不到原來基礎值的2倍，或存在出血表現(xiàn)。激素依賴：需要持續(xù)使用激素，使血小板計數(shù)>30×109/L或避免出血。在進行療效判斷時，至少檢測兩次血小板計數(shù)，兩次間隔7 d以上。

2 結 果

2.1兩組間25(OH)D3和T淋巴細胞相關細胞因子水平比較 患兒組25(OH)D3、IL-4和IL-10水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；純航MIL-2和IL-17水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組間IL-6、TNF-α和IFN-γ比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組間25(OH)D3和T淋巴細胞相關細胞因子水平比較

組別nIL-10(pg/mL)IL-17(pg/mL)TNF-α(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)對照組6010.93±1.562.55±0.414.95±0.967.34±1.20患兒組1273.02±0.7912.40±1.935.40±1.148.08±1.32P<0.05<0.05>0.05>0.05

2.2不同25(OH)D3水平ITP患兒T淋巴細胞相關細胞因子比較 由于患兒組與對照組25(OH)D3、IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。故對不同25(OH)D3水平患兒組間進行IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平的比較。不同25(OH)D3水平的患兒組間IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。2.3治療4個月后有效組和無效組間25(OH)D3及T淋巴細胞相關細胞因子水平比較 125例患兒治療4個月后的轉歸情況：有效111例(有效組)，無效12例(無效組)，激素依賴4例。有效組25(OH)D3、IL-4、IL-10水平高于無效組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有效組IL-2和IL-17水平低于無效組，而IL-4、IL-10的水平高于無效組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 不同25(OH)D3水平的ITP患兒T淋巴細胞相關細胞因子水平比較

表3 治療4個月后有效組和無效組間25(OH)D3及T淋巴細胞相關細胞因子水平比較

3 討 論

ITP的發(fā)病機制復雜多樣，目前的研究已經(jīng)證實，體液免疫介導的血小板抗體生成與細胞免疫過程中的Th1/Th2比例失衡是其重要的發(fā)病原因[2]。但是ITP患者面對激素等治療手段有不同反應，而且后期臨床轉歸也不完全相同，因此ITP的發(fā)病機制仍需要更加深入的研究，特別是需要關注急性ITP向慢性發(fā)展過程中各項檢測指標的變化。維生素D3在機體中經(jīng)過肝臟和腎臟的代謝生成25(OH)D3和1,25(OH)2D3。有研究證實，25(OH)D3和1,25(OH)2D3能夠調節(jié)Th1和Th17等T淋巴細胞的激活，進而影響T細胞分化，參與了類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[8]，而Th1細胞與ITP具有直接的關系，故探討25(OH)D3與ITP患兒的T細胞相關細胞因子表達的關系具有較大的臨床意義。

本研究顯示，與對照組比較，患兒組Th1類細胞因子IL-2水平明顯升高，這表明Th1處于高度激活狀態(tài)；Th17類細胞因子IL-17水平明顯升高，這提示Th17處于高度激活狀態(tài)；而Th2類細胞因子IL-4和IL-10水平明顯下降，這說明Th2細胞處于激活抑制狀態(tài)。在本研究中，患兒組Th1/Th2處于升高狀態(tài)，這個比例升高，表明患兒Th1處于優(yōu)勢，這與LAZARUS等[9]的研究一致。但是有研究發(fā)現(xiàn)，Th1優(yōu)勢可能并不明顯，甚至傾向于Th2，這說明在兒童ITP患者中Th1/Th2比例失衡確實存在，但是這種失衡具有明顯的差異性，可能會隨著群體的差異性而出現(xiàn)明顯的異質性[10-12]。Th17是一類CD4陽性的T淋巴細胞，其能夠產生IL-17，在炎性損傷和非特異性免疫中具有重要的作用，但是Th17在ITP患兒中的水平變化仍然具有較大的爭議，不同ITP的群體可能表現(xiàn)出截然相反的結果[12-14]。Th1與Th17誘導免疫應答，而Th2抑制免疫應答，介導免疫耐受，維持免疫調節(jié)的平衡，在本研究中顯示ITP患兒Th1和Th17活化，免疫應答強度增強，而Th2抑制，免疫應答的限制減弱，是ITP發(fā)生的重要原因。

本研究中，以25(OH)D3水平高低對ITP患兒進行分組，檢測結果顯示，缺乏組Th1和Th17類細胞因子IL-2和IL-17水平更高，說明Th1和Th17的激活更加明顯，機體的免疫應答更加強烈，這對具有明顯自身免疫傾向的ITP患兒更加不利。而且抑制免疫應答和介導免疫耐受的Th2類細胞因子IL-4和IL-10在缺乏組中的降低程度更加明顯，Th1/Th2的比例失衡更加顯著。25(OH)D3水平與ITP患兒T淋巴細胞相關細胞因子水平有關，可能的原因是25(OH)D3能夠促進Th1/Th2和Th17的成熟分化，減少促炎性細胞的異常激活，促進抑炎性細胞的成熟和穩(wěn)定，最終達成一種特殊的內穩(wěn)態(tài)[14-16]。對治療無效的12例ITP患兒進行分析，結果顯示治療無效的患兒25(OH)D3、IL-4和IL-10水平明顯降低，而IL-2和IL-17水平明顯升高。這說明不僅Th1、Th2和Th17比例的失衡是ITP發(fā)生、發(fā)展和預后的重要影響因素，25(OH)D3水平也可能是急性ITP遷延不愈，并向慢性轉變的重要因素。雖然隨訪4個月的時間可能不夠，因為不能完全反映ITP患兒的最終臨床轉歸，但是治療4個月無效能夠預測其慢性轉歸的可能，故對臨床具有指導意義。

綜上所述，ITP患兒的25(OH)D3水平存在明顯的下降，與T淋巴細胞的相關因子水平有關。25(OH)D3水平可能是兒童ITP治療效果和臨床轉歸的影響因素，但是具體機制仍有待進一步的研究。