關小珊，唐 倩，鄧秋連，鐘華敏，高坎坎，劉海英

廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童院區(qū)檢驗科，廣東廣州 510120

B族鏈球菌(GBS)正常定植于婦女下生殖道，為圍生期新生兒敗血癥、肺炎和腦膜炎的主要致病菌[1-2]?；谠型砥贕BS篩查或臨床高危因素評估的產(chǎn)時抗菌藥物干預是當前預防新生兒GBS感染唯一有效的措施，而及時的抗菌治療直接決定患兒的臨床預后[3]。盡管喹諾酮類抗菌藥物不用于孕婦和兒童感染的治療，但多重耐藥GBS菌株的耐藥譜易產(chǎn)生協(xié)同效應，使常規(guī)使用的抗菌藥物敏感性降低，而且細菌間耐藥質(zhì)粒的水平傳播大大加快了喹諾酮耐藥的傳播。本研究旨在調(diào)查本中心2014-2019年的GBS喹諾酮耐藥狀況，并探討耐藥突變位點與菌株血清學分型之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取從2014年1月至2019年12月于本中心確診為GBS感染的嬰兒血液﹑腦脊液標本中分離出的非重復菌株共120株作為研究對象。納入標準：(1)菌株來源患兒有1個或多個正常情況下無菌部位GBS培養(yǎng)陽性；(2)菌株來源患兒符合GBS感染診斷標準時，日齡不超過90 d。本研究通過廣州市婦女兒童醫(yī)療中心醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2儀器與試劑 主要儀器包括法國生物梅里埃公司VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定和藥敏分析儀和配套藥敏試驗卡、德國Biometra公司PCR儀。PCR檢測試劑購自Takara公司；血清學分型試劑盒購自丹麥SSI公司；質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619，購自國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗 把GBS臨床分離株從-80 ℃冰箱取出，復蘇并增菌；用VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定藥敏分析儀進行藥敏檢測，結(jié)果判讀參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)[4]及歐洲藥敏試驗聯(lián)合委員會(EUCAST)[5]標準。菌株對2種喹諾酮類抗菌藥物(本研究中為左氧氟沙星和莫西沙星)中的1種耐藥即為喹諾酮耐藥菌株。

1.3.2血清學分型 使用Oxoid公司Strep-B-Latex快速乳膠凝集試劑盒對GBS進行血清學分型：準備220 μL濃菌懸液，每孔分別加入20 μL的細菌懸液及5 μL的膠乳試劑(兔抗血清Ⅰa、Ⅰb和Ⅱ～Ⅸ)，充分混勻并輕搖15～30 s，30 s內(nèi)出現(xiàn)凝集則判定為陽性。

1.3.3PCR 根據(jù)文獻[6]設計引物，GyrA和ParC的引物序列見表1。用煮沸法提取GBS臨床分離株基因組DNA作為模板，PCR反應總體積為20 μL。GyrA的PCR參數(shù)設置：94 ℃ 3 min，94 ℃ 60 s、45 ℃ 60 s、68 ℃ 60 s共30個循環(huán)，68 ℃ 6 min；ParC的PCR參數(shù)設置：94 ℃ 3 min，94 ℃ 60 s、48 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s共30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。

表1 GyrA和ParC基因引物序列

1.3.4電泳及測序 反應結(jié)束后，進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存。將以喹諾酮耐藥菌株基因組DNA為模版的GyrA和ParC PCR陽性產(chǎn)物直接送華大基因公司測序，將測序結(jié)果與從Gene Bank數(shù)據(jù)庫下載的參考菌株的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDRs)序列用CLC Genomics Workbench 12.0和ExPASy軟件進行比對，從而確定堿基突變引起的氨基酸改變。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗 120株GBS對青霉素﹑萬古霉素和利奈唑烷100.0%敏感，其中14株為喹諾酮耐藥菌株。本研究中，GBS的喹諾酮耐藥率為11.7%(14/120)，近4年(2016-2019年)的耐藥率分別為9.7%(3/31)、15.4%(2/13)、21.4%(6/28)、17.6%(3/17)。

2.2GyrA和ParC PCR產(chǎn)物的電泳檢測 凝膠電泳顯示，擴增產(chǎn)物與預期目的片段大小一致，見圖1、2。

注：1～11為喹諾酮耐藥菌株；12為喹諾酮敏感株；13為標準株；M為分子標準帶。圖1 GyrA PCR產(chǎn)物電泳圖

注：1～11為喹諾酮耐藥菌株；12為喹諾酮敏感株；13為標準株；M為分子標準帶。圖2 ParC PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3靶基因測序及比對 11株喹諾酮耐藥菌株100%存在GyrA的堿基突變，且均為錯義突變，導致的氨基酸改變包括81位絲氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)，219位丙氨酸(Ala)→脯氨酸(Pro)或纈氨酸(Val)。僅存在GyrA(Ser81Leu)單位點突變的占36.36%(4/11)，同時存在GyrA(Ser81Leu和Ala219Pro)或GyrA(Ser81Leu和Ala219Val)雙突變的分別占45.45%(5/11)和9.10%(1/11)。僅1株耐藥株有ParC的有義突變，且與GyrA突變同時出現(xiàn)；血清學分型顯示，Ⅲ型占90.9%(10/11),Ⅰb型占9.1%(1/11)，見表2。

表2 喹諾酮耐藥菌株GyrA與ParC基因突變導致的氨基酸改變及血清學分型

3 討 論

本研究顯示，120株GBS中的喹諾酮耐藥率為11.7%(14/120)，與法國報道的1.5%(新生兒標本1例)[7]、意大利報道的3.0%[8]，以及中國臺灣地區(qū)報道的6.2%[9]相比，本中心分離的GBS對左氧氟沙星的耐藥率較高。這種差異可能與標本來源有關，也可能與嬰兒感染的特定流行病學特征有關。

喹諾酮類抗菌藥物屬于臨床常用抗菌藥物，具有廣泛的抗菌譜，當前應用的喹諾酮類抗菌藥物主要以第4代為主[10]。目前，革蘭陽性菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制主要是拓撲異構酶靶位點改變，即QRDRs特異位點發(fā)生突變介導的耐藥，這些突變位點主要位于GyrA、GyrB、ParC、ParE的活性區(qū)域，尤其以GyrA和ParC上的突變最為常見。最常見的位點突變有ParC(Ser79Phe)和GyrA(Ser81Leu)雙突變，此外還有ParC(Ser80Pro)的報道[7-8]。本研究顯示，所有喹諾酮耐藥GBS菌株均存在GyrA(Ser81Leu)突變，其中僅存在GyrA(Ser81Leu)單位點突變的占36.36%，同時存在GyrA(Ser81Leu和Ala219Pro)或GyrA(Ser81Leu和Ala219Val)雙突變的分別占45.45%和9.10%，經(jīng)檢索萬方數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)和Medline數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，GyrA219號位的點突變國內(nèi)外未見報道。此外，本研究中的GBS菌株不存在ParC(Ser79Phe)這種常見突變，盡管11株喹諾酮類耐藥GBS均存在ParC基因序列的堿基突變(多數(shù)為4個不同堿基的單位點突變)，但僅有1株ParC(Ile218Thr和Ile219Phe)為有義突變，推測上述兩種新的氨基酸位點突變可能與藥物作用后酶的構型變化以及結(jié)合位點的改變有關。

本研究發(fā)現(xiàn)存在有GyrA和ParC基因突變的喹諾酮耐藥GBS菌株血清學分型多為Ⅲ型，與國內(nèi)報道一致[11]，與法國GBS分離株ST-19/CPS Ⅴ型在喹諾酮耐藥菌株中的占比較高的報道[7]存在差異。這可能與標本來源有關，也可能與不同國家和地區(qū)的地理位置、氣候條件、種族差異等造成GBS感染菌株血清學型別譜的差異有關。

需要說明的是，鑒于美國CLSI與EUCAST均無環(huán)丙沙星的藥敏試驗的判定標準，因此本研究僅以左氧氟沙星和莫西沙星耐藥作為喹諾酮耐藥的判定標準。

綜上所述，本中心2014年1月至2019年12月從嬰兒臨床標本分離的喹諾酮耐藥GBS菌株血清學分型以Ⅲ型為主，并且檢測出了新的GyrA和ParC基因突變位點。持續(xù)調(diào)查GBS對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥趨勢及耐藥基因突變，對于預防耐藥菌的產(chǎn)生，控制多重耐藥菌的形成，以及新藥的開發(fā)具有重要的參考價值。