郭娟英，劉傳芳，肖 麗，杜 媛，方 菲，鄭明俠，尚粉青△

1.西安建筑科技大學(xué)校醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安710000；2.陜西省西安市第一醫(yī)院/西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安710002

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶或脫羧酶。近年來國內(nèi)外研究表明血清PCSK9與動脈粥樣硬化顯著相關(guān)[1]。一項大型臨床研究提示，PCSK9抑制劑可有效降低血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，降低心血管事件發(fā)生風(fēng)險，對于超高?；颊哂懈@著的獲益[2]。而2型糖尿病一直是心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的超高危險因素，該病患者冠狀動脈血管彌漫性病變多見，小血管病變多見，支架內(nèi)再狹窄亦多見[3]。因此本研究著重探討2型糖尿病患者血清PCSK9水平升高的作用機(jī)制及意義，為今后進(jìn)一步有效防治心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1-10月西安建筑科技大學(xué)校醫(yī)院體檢者中的2型糖尿病患者74例作為糖尿病組，同時選取與其年齡、性別相匹配的體檢健康者76例作為對照組。2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：確診冠心病、高脂血癥者，惡性腫瘤、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重的心肝腎功能損害、甲狀腺功能疾病，近期服用他汀類及類固醇激素藥物者。兩組對象一般情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過西安建筑科技大學(xué)校醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 血清PCSK9檢測使用的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自Elabscience公司。主要儀器包括實時熒光定量PCR(qPCR)儀及梯度PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、Western blot電泳儀、電泳槽、自動洗片機(jī)(柯達(dá)公司)。主要試劑：葡萄糖粉購自西安市第一醫(yī)院藥劑科；Betulin購自Sigma公司。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)、PCSK9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等qPCR引物由擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。siRNA-SREBP2由生工生物公司合成。SREBP2抗體、PCSK9抗體均購自Cell Signaling公司，β-actin抗體購自Santa Cruz公司。蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自羅氏公司；ECL發(fā)光液購自Vazyme公司和Millipore公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；HiScriptTMqPCR SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Vazyme公司；PCR DNA聚合酶購自Vazyme公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

表1 PCR引物序列

1.3方法

1.3.1人肝癌細(xì)胞株HepG2的培養(yǎng)及處理 HepG2細(xì)胞株由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究中心贈予。使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代。以不同水平葡萄糖(高水平：30 mmol/L；低水平：5 mmol/L)孵育HepG2細(xì)胞24 h。抑制SREBP2：使用SREBP2的特異性抑制劑Betulin或轉(zhuǎn)染SREBP2 siRNA(10 μmol/L)抑制細(xì)胞SREBP2。

1.3.2血清學(xué)檢測 血清PCSK9水平的檢測采用ELISA。空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等臨床生化指標(biāo)送西安建筑科技大學(xué)校醫(yī)院檢驗科進(jìn)行檢測。HbA1c的檢測采用Alere Afinion AS100型特種蛋白干式免疫散射色譜分析儀。

1.3.3Western blot檢測 6孔板中的細(xì)胞先用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗2遍，加入蛋白裂解液約120 mL，使用液氮進(jìn)行凍融3次，在4 ℃下進(jìn)行離心，離心速度為12 000 r/min，離心時間為15 min，之后取上清液，再使用ABC法對蛋白水平進(jìn)行測量。之后加入上樣緩沖液，設(shè)置溫度為95 ℃，8 min后蛋白變性。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(其中下層膠50 mA、90 min，上層膠30 mA、30 min)，轉(zhuǎn)膜電流為230 mA，時間為1 h，再用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，時間為1 h，在4 ℃下孵育一抗進(jìn)行過夜，使用TTBS液洗3遍，每遍時間為5 min；在室溫1 h下孵育二抗；使用ECL發(fā)光，自動洗片機(jī)洗片。標(biāo)定蛋白條帶后掃描、分析。

1.3.4qPCR檢測 先用PBS清洗6孔板中的細(xì)胞2遍，之后加入Trizol液，提取RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA水平。參照HiScriptTMqPCR SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。然后進(jìn)行qPCR檢測，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1對照組與糖尿病組血清PCSK9水平比較 糖尿病組血清PCSK9水平高于對照組[(22.22±9.63)ng/mLvs.(12.46±6.22)ng/mL，P<0.001]。

2.2對照組與糖尿病組一般資料及臨床生化檢測結(jié)果比較 糖尿病組TC、TG、LDL-C、FPG、HbA1c、HDL-C、hs-CRP水平均高于對照組(P<0.05)；兩組間Hcy水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 對照組與糖尿病組一般情況及相關(guān)生化檢測結(jié)果

組別nHDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)FPG(x±s,mmol/L)HbA1c(x±s,%)Hcy(x±s,μmol/L)hs-CRP(x±s,mg/L)對照組761.07±0.142.34±0.515.04±0.865.2±1.0510.35±2.961.65±0.69糖尿病組741.10±0.252.62±0.74*7.63±1.53*7.67±1.83*10.41±2.544.12±1.32*

2.3血清PCSK9水平與LDL-C、hs-CRP水平的相關(guān)性 血清PCSK9水平與LDL-C、hs-CRP水平呈正相關(guān)(r=0.593、0.424,P<0.05)，見圖1。

注：A為PCSK9水平與LDL-C水平的相關(guān)性分析；B為PCSK9水平與hs-CRP水平的相關(guān)性分析。圖1 血清PCSK9水平與LDL-C、hs-CRP水平的相關(guān)性分析

2.4不同水平葡萄糖孵育對HepG2細(xì)胞PCSK9、SREBP2表達(dá)水平的影響 采用不同水平葡萄糖孵育HepG2細(xì)胞后，qPCR及Western Blot檢測PCSK9的表達(dá)情況，結(jié)果顯示高水平葡萄糖孵育細(xì)胞的PCSK9、SREBP2表達(dá)水平高于低水平葡萄糖孵育的細(xì)胞(P<0.05)，見圖2。

注：與5 mmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01；A為qPCR檢測SERBP2和PCSK9的mRNA相對表達(dá)水平；B為Western blot檢測PCSK9、SREBP2的表達(dá)情況;5 mmol/L、30 mmol/L為葡萄糖水平。圖2 高水平葡萄糖對SREBP2和PCSK9表達(dá)的影響

2.5抑制SREBP2后對PCSK9表達(dá)的影響 抑制SREBP2后，HepG2細(xì)胞PCSK9表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖3。

注：與5 mmol/L比較，**P<0.01；與30 mmol/L比較，#P<0.05，##P<0.01；A為qPCR檢測PCSK9的mRNA相對表達(dá)水平；B為Western blot檢測PCSK9的表達(dá)情況;5 mmol/L、30 mmol/L為葡萄糖水平。圖3 抑制SREBP2對PCSK9表達(dá)的影響

3 討 論

已有的研究表明，PCSK9水平與冠心病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]。冠心病患者血清PCSK9水平顯著高于健康人群；多支血管病變患者PCSK9水平明顯較雙支血管病變或單支血管病變患者高；PCSK9與體質(zhì)量指數(shù)、年齡、TG、TC、收縮壓、FPG、LDL-C、Gensini評分等呈正相關(guān)[6]，PCSK9水平與hs-CRP及IL-10水平呈正相關(guān)[7]。PCSK9抑制劑在他汀類藥物的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步降低LDL-C水平，能逆轉(zhuǎn)冠狀動脈斑塊的形成，降低主要心血管事件風(fēng)險；PCSK9抑制劑治療獲益程度隨時間不斷增加，第1年相對風(fēng)險降低16%，大于1年后相對風(fēng)險可降低至25%；PCSK9抑制劑可以給“極高風(fēng)險”的動脈硬化性心血管疾病患者帶來更顯著的心血管獲益[2]。

2型糖尿病作為冠心病的危險因素，可導(dǎo)致彌漫性的血管病變，合并糖尿病的冠心病患者較單純冠心病患者的血管病變更嚴(yán)重，植入支架數(shù)量也更多，支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率也更高，預(yù)后較差[4]。本研究證實，糖尿病患者血清PCSK9水平明顯升高，而且與血清LDL-C、hs-CRP水平呈正相關(guān)，與劉云濤等[8]的報道一致。糖尿病患者血清PCSK9水平與血清胰島素、HbA1c水平顯著相關(guān)[9-10]，而他汀類藥物可以上調(diào)PCSK9水平[11-12]，PCSK9又會限制其降低LDL-C水平的藥理作用。因此糖尿病患者血管病變及并發(fā)癥的發(fā)生可能與血清PCSK9水平密切相關(guān)。

本研究進(jìn)一步探討了2型糖尿病患者血清PCSK9水平升高的作用機(jī)制及臨床意義。肝臟是合成和分泌PCSK9的重要器官，因此本研究使用了HepG2細(xì)胞進(jìn)行機(jī)制研究，高水平葡萄糖孵育HepG2細(xì)胞使細(xì)胞PCSK9表達(dá)增加。PCSK9的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子SREBP2調(diào)控，其通過結(jié)合基因啟動子區(qū)域中的固醇調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)PCSK9的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞膽固醇水平降低時，SREBP2被激活。激活的SREBP2使PCSK9表達(dá)水平升高。PCSK9結(jié)合肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體并使其降解，從而使LDL-C水平升高。糖尿病患者血液的高水平葡萄糖可激活SREBP2并促進(jìn)PCSK9表達(dá)，從而限制了他汀類藥物的降脂效果。PCSK9與炎癥[13]的密切關(guān)系可能是糖尿病患者血管病變嚴(yán)重的原因之一。