馬子甲，張凱杰，陸勝民，，*，徐志豪，鄭美瑜，劉 哲，王 璐，楊 穎

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321000；2.江蘇楷益智能科技有限公司，江蘇 無錫 214100；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

芹菜(ApiumgraveolensL.)別名芹、早芹、香芹、蒲芹、藥芹菜、野芫荽，為傘形科芹屬中一、二年生草本植物[1]，在我國(guó)栽培歷史悠久，分布很廣，全國(guó)大部分地區(qū)均有栽培。其含有多種活性物質(zhì)[2-4]，主要包括類黃酮物質(zhì)及其苷類化合物(芹菜素、木犀草素)、苯酞類化合物等[5-6]。芹菜具有很好的藥用功能[7-8]，其所含的黃酮類物質(zhì)，包括黃酮及其衍生物多以苷態(tài)存在，具有調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的脆性和通透性、降血壓、降血脂、清除自由基抗氧化、抗凝血和抗血栓形成、抵抗心血管疾病等功效[9-10]。芹菜的根、莖、葉、籽具有降血壓的作用，在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中也得到了進(jìn)一步證實(shí)[11-12]。目前，芹菜中降血壓活性物質(zhì)研究較多的是黃酮化合物和多酚類化合物，其中，具有降壓作用的黃酮類物質(zhì)主要為槲皮素、芹菜素和木犀草素[13]，其降壓機(jī)制可能與減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，以及以內(nèi)皮依賴性和非依賴性方式改善血管內(nèi)皮功能等有關(guān)。芹菜中的多酚類化合物主要有咖啡酸、綠原酸、黃烷醇及其衍生物[14]，多酚類化合物通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性、減少細(xì)胞黏附分子表達(dá)等機(jī)制預(yù)防心血管疾病發(fā)生[15]。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin coverting enzyme，ACE)活性在調(diào)節(jié)動(dòng)脈血壓中起關(guān)鍵作用[16]，ACE通過催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為有效的血管收縮劑血管緊張素Ⅱ而達(dá)到升高血壓的作用。黃酮類化合物是一種很好的功能性降壓物質(zhì)，對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶具有抑制作用[17]，木犀草素、槲皮素、蘆丁、山奈酚和芹菜素在體外有很好的ACE抑制活性[18]。

本文對(duì)19個(gè)品種芹菜葉水提物的體外ACE抑制活性、總酚和總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，篩選出ACE抑制活性較強(qiáng)和活性成分含量較高的8種芹菜，測(cè)定其葉和莖水提物的ACE半抑制濃度(IC50)，以選出體外ACE抑制活性最高或活性成分含量高的芹菜品種，為芹菜的食用和降血壓活性成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)芹菜品種共計(jì)19個(gè)(表1)，所用的芹菜籽由國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源共享服務(wù)平臺(tái)-蔬菜種質(zhì)資源子平臺(tái)、國(guó)家蔬菜種質(zhì)資源中期庫(kù)提供，并且由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所統(tǒng)一栽培，栽培基地位于桐鄉(xiāng)市鳳鳴衛(wèi)杰家庭農(nóng)場(chǎng)。

1.2 試劑與儀器

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(酶活性為2.0 U·mg-1)，Sigma公司；蘆丁(分析純，97%)、沒食子酸(分析純，98.5%)、卡托普利、馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(分析純，98%)，上海源葉生物科技有限公司；福林酚，上海麥克林生化科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、碳酸鈉、硼酸、四硼酸鈉、氯化鈉均為分析純。

BS200S-WE1電子天平，余姚金諾電子天平儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LXJ-HB飛鴿低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，杭州明遠(yuǎn)儀器有限公司；UV-1800紫外/可見分光光度儀，日本島津公司；DK-8B型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

采用福林酚比色法[15]，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 100 mg·L-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，加入2.5 mL Folin Ciocalteu顯色劑，搖勻；再加入5 mL 5%碳酸鈉溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm處測(cè)定其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)，制作總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法[19]，稱取無水蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，加無水乙醇制成200 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取該溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4% NaOH溶液10 mL，搖勻，加水至刻度，放置15 min后在509 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以無水蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)，制作總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 芹菜ACE抑制活性的測(cè)定

參考Cushman等[20]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，具體操作步驟為：取5 mmol·L-1的馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)溶液200 μL加入4組試管中，分別標(biāo)記為A、B、C、D；A、B兩組加入pH值8.3的硼酸緩沖液30 μL，C、D兩組加入等體積的抑制劑(芹菜提取物)，混勻后在37 ℃保溫5 min；然后A、C兩組加入0.06 U·mL-1ACE溶液100 μL，B、D兩組加入等體積pH值8.3的硼酸緩沖液，混勻后在37 ℃反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后4組試管均加入250 μL 1 mol·L-1HCl終止反應(yīng)。然后均加入1 500 μL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4 000×g離心10 min后取1 mL上層乙酸乙酯萃取液于另一試管，沸水浴15 min蒸發(fā)去除乙酸乙酯；再加入3 mL蒸餾水于試管中溶解殘留物，在228 nm處測(cè)定吸光值。5 mmol·L-1的HHL溶液和0.05 U·mL-1的ACE溶液均由0.1 mol·L-1含有0.3 mol·L-1NaCl的磷酸緩沖液(pH值8.3)配制。ACE抑制活性(I，%)計(jì)算公式如下：

(1)

式(1)中：DA，含ACE、不含抑制劑時(shí)的吸光度；DB，不含ACE和抑制劑時(shí)的吸光度；DC，同時(shí)含有ACE和抑制劑時(shí)的吸光度；DD，不含ACE但含抑制劑時(shí)的吸光度。

1.3.4乙醇濃度對(duì)芹菜葉體外ACE抑制活性的影響

在相同提取條件[料液比1∶30(g·mL-1)、提取時(shí)間2 h、提取溫度60 ℃]下，用不同濃度(0、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液(用蒸餾水配制)提取四季慢芹菜葉凍干粉，4 000×g離心10 min后取上清，用冷凍干燥機(jī)凍干提取液后用蒸餾水溶解稀釋到2 mg·mL-1，按照1.3.3節(jié)的方法，測(cè)定其體外ACE抑制活性。

1.3.5 ACE抑制活性與活性成分測(cè)定

將凍干的不同品種芹菜葉粉碎，稱取0.50 g芹菜葉粉，以蒸餾水為提取劑，在相同條件[料液比1∶30(g·mL-1)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h]下提取，4 000×g離心10 min后取上清，按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行體外ACE抑制活性測(cè)定，按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定樣品總酚含量，按照1.3.2節(jié)的檢測(cè)方法測(cè)定樣品總黃酮含量。

1.3.6 體外ACE IC50測(cè)定

稱取初步篩選出來的8種芹菜品種的葉和莖凍干粉各1.00 g，以蒸餾水為提取劑，在相同條件[料液比1∶30(g·mL-1)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h]下提取，4 000×g離心10 min后取上清液凍干即為芹菜提取物凍干粉。稱取上述芹菜提取物凍干粉0.10 g，加蒸餾水稀釋成5個(gè)濃度梯度，分別為0.781 25、1.562 5、3.125、6.25和12.5 mg·mL-1，測(cè)定其體外ACE抑制活性。用Origin 2021軟件擬合ACE抑制活性曲線，計(jì)算芹菜體外ACE半抑制濃度(IC50)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS Statistics 25對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，然后利用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)測(cè)定的指標(biāo)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析。運(yùn)用Origin 2021軟件對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行熱圖繪制，篩選出體外ACE抑制活性最高的芹菜品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)芹菜葉體外ACE抑制活性的影響

由圖1可知：在不添加乙醇即提取液為水時(shí)，芹菜葉提取物的ACE抑制活性最高，為91.81%；乙醇濃度為80%時(shí)，提取物的ACE抑制活性為負(fù)，表示其對(duì)ACE沒有抑制活性，這可能與其凍干粉用水復(fù)溶時(shí)不完全溶解有關(guān)。

柱上無相同小寫字母表示試驗(yàn)組間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 體外ACE抑制活性與活性成分含量

由表1可知，19個(gè)品種芹菜葉水提物都有體外ACE抑制活性，集中在80%～100%，其中，涇川芹菜葉的體外ACE抑制活性最低，為(79.79±1.02)%，而紫芹葉的體外ACE抑制活性最高，達(dá)到了(105.13±1.41)%，這可能是由于芹菜葉提取物中降壓活性物質(zhì)濃度較高造成的。蘆丁濃度為0～48 mg·L-1時(shí)與吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=0.011 1x-0.020 5，R2=0.995 5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到19個(gè)品種芹菜葉水提物的總黃酮含量，總黃酮含量集中在200～250 mg·L-1，中位數(shù)為234.7 mg·L-1；其中，白芹葉水提物的總黃酮含量最低，為(168.38±0.88)mg·L-1，白梗芹菜葉水提物的總黃酮含量最高，為(261.71±2.43)mg·L-1。沒食子酸濃度為0～8 mg·L-1時(shí)與吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=0.100 5x+0.016，R2=0.999 5；根據(jù)總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到19個(gè)品種芹菜葉水提物中總酚含量集中在130～150 mg·L-1，中位數(shù)為140 mg·L-1，其中，空桿綠芹葉水提物的總酚含量最低，為(119.40±1.29)mg·L-1，紫芹葉水提物的總酚含量最高，為(182.49±3.65)mg·L-1。

表1 不同品種芹菜葉體外ACE抑制活性及其總黃酮、總酚含量

2.3 體外ACE抑制活性與總酚、總黃酮含量熱圖分析和相關(guān)性分析

從圖2可以看出，芹菜葉水提物體外ACE抑制活性較好的品種按活性高低依次為紫芹、細(xì)葉芹菜、青梗芹菜、青藥芹；總酚含量較高的品種依次為紫芹、四季慢芹菜、細(xì)葉芹菜、Ts123.010、青梗芹菜；黃酮含量較高的品種依次為白梗芹菜、青梗芹菜、青藥芹、細(xì)葉芹菜。體外ACE抑制活性較高的幾個(gè)品種如細(xì)葉芹菜、青梗芹菜等，其總酚或總黃酮含量也較高，說明體外ACE抑制活性與總酚或總黃酮含量有一定相關(guān)性?？諚U芹菜的總酚和總黃酮含量較低，但其體外ACE抑制活性卻較高，說明總黃酮或總酚含量與ACE抑制活性不完全成正相關(guān)，體外ACE抑制活性可能是受其他水溶性成分影響。進(jìn)一步對(duì)不同品種芹菜葉體外ACE抑制活性、總黃酮含量和總酚含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示，體外ACE抑制活性與總酚、總黃酮含量均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)介于0.3～0.6，說明芹菜葉體外ACE抑制活性與其總黃酮、總酚含量有弱相關(guān)性。

表2 不同品種芹菜葉的體外ACE抑制活性、總黃酮含量和總酚含量的相關(guān)性

在同一行中顏色越深、數(shù)字越大表示體外ACE抑制活性或總酚、總黃酮含量越高，圖中芹菜品種編號(hào)與表1對(duì)應(yīng)。

2.4 不同品種芹菜葉和莖的體外ACE IC50值

以芹菜葉體外ACE抑制活性為主指標(biāo)，芹菜葉總酚和總黃酮含量為輔助指標(biāo)，在19種芹菜品種中篩選出較好的8種，分別為四季慢芹菜、紫芹、白藥芹、白梗芹菜、青梗芹菜、重慶白芹菜、細(xì)葉芹菜、青藥芹?？紤]到可食用部分莖葉中的活性成分有一定的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步篩選高活性芹菜品種，分別測(cè)定葉和莖的體外ACE IC50，其值越小表示ACE抑制活性越高。從圖3可看出，各品種芹菜葉的ACE IC50約為莖的1/3，說明芹菜葉對(duì)ACE的抑制效果顯著(P<0.05)好于芹菜莖。白藥芹葉的體外ACE IC50最大，為5.063 mg·mL-1，青梗芹菜葉和四季慢芹菜葉的最小，分別為1.258 mg·mL-1和1.368 mg·mL-1，說明其對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制效果最好，其體外降壓活性最高；其次為白芹菜(1.829 mg·mL-1)、白梗芹菜(2.298 mg·mL-1)、紫芹(2.591 mg·mL-1)、細(xì)葉芹菜(2.642 mg·mL-1)、青藥芹(3.835 mg·mL-1)。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖中芹菜品種編號(hào)與表1對(duì)應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

芹菜來源廣泛，是人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖卟酥?，但是在平時(shí)食用習(xí)慣中會(huì)丟棄芹菜葉而食用芹菜莖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芹菜葉體外ACE IC50約為莖的1/3，說明芹菜葉中降血壓物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于芹菜莖。孫華林等[12]研究表明，在芹菜根、莖、葉3個(gè)部位中，芹菜葉對(duì)調(diào)節(jié)大鼠高血壓和血脂代謝絮亂的效果最明顯，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。Che等[21]研究表明，水提可以提高天然產(chǎn)物的生物活性，在提取溫度較高時(shí)不僅利于水溶性降血壓活性物質(zhì)的提取，還利于部分可溶于熱水的黃酮類物質(zhì)提取，這可能是本研究中芹菜葉水提物比醇提物的體外ACE抑制活性更高的原因。賈麗麗等[22]研究表明，不同芹菜品種之間營(yíng)養(yǎng)成分含量差異較大，本研究中不同芹菜品種之間體外ACE抑制活性亦有差異，不同品種芹菜其性狀也不同，有的品種芹菜葉顏色較深如紫芹，有的品種芹菜葉顏色較淺如白芹?；ㄉ站哂薪笛獕鹤饔肹23]，Ojeda等[24]發(fā)現(xiàn)，飛燕草色素-3-O-桑布雙糖苷和矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中不同芹菜品種的體外ACE抑制活性不同可能與其所含的花色苷含量不同有關(guān)，因?yàn)樯钌~如紫芹葉通常富含花色苷。

通過對(duì)四季慢芹菜、紫芹、白藥芹等19個(gè)芹菜品種的體外ACE抑制活性及其總黃酮和總酚含量的測(cè)定，選出紫芹、青梗芹菜、細(xì)葉芹菜、青藥芹等8個(gè)活性較高的芹菜品種。青梗芹菜葉體外ACE半抑制率最低，其次為四季慢芹菜葉，對(duì)ACE抑制效果由高到低為青梗芹菜、四季慢、白芹菜、白梗芹菜、紫芹、細(xì)葉芹菜、青藥芹和白藥芹。本文篩選出的青梗芹菜、紫芹等品種可以作為芹菜降血壓活性成分研究與利用的優(yōu)選品種。

致謝：感謝桐鄉(xiāng)市鳳鳴衛(wèi)杰家庭農(nóng)場(chǎng)時(shí)衛(wèi)杰對(duì)本實(shí)驗(yàn)芹菜栽培提供的幫助。