高娉娉，溫華婷，趙 美，王 婧，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

葡萄酒釀造過程是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)為主導(dǎo)的酒精發(fā)酵，為了提高葡萄酒酒體微生物的穩(wěn)定性，通常結(jié)合乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation，MLF)。然而，乳酸菌主導(dǎo)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵是一個復(fù)雜的代謝過程，會產(chǎn)生一些影響葡萄酒質(zhì)量的物質(zhì)，如生物胺[1]。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)在葡萄酒釀造方面的應(yīng)用，以期提高葡萄酒品質(zhì)。研究較多的非釀酒酵母主要有戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)[2]、檸檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)[3]、有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)[4]、假絲酵母(Candidapulcherrima)[5]、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)[6]、異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)[7]和耐熱克魯維酵母(Lachanceathermotolerans)[8]。這些研究報告顯示，釀酒酵母和非釀酒酵母菌株混菌發(fā)酵能夠增加酒體中甘油、總酸、揮發(fā)性酯類物質(zhì)含量，降低乙酸含量，形成穩(wěn)定的吡喃型花色苷類物質(zhì)，對提升葡萄酒感官品質(zhì)具有積極影響。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe，S.pombe)早期被認為是造成葡萄酒腐敗變質(zhì)的原因之一，其代謝產(chǎn)生的乙酸、乙醛和乙酸乙酯會給葡萄酒帶來不良的風(fēng)味[6]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，一些優(yōu)選的S.pombe具有獨特的代謝特性，不僅能夠作為生物脫酸劑將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，使葡萄酒口感柔和[9]；而且可以用來提高葡萄酒中吡喃花青素的含量，改善紅葡萄酒顏色穩(wěn)定性[10]。同時，S.pombe產(chǎn)生的脲酶可減少氨基甲酸乙酯和組胺等生物胺的產(chǎn)生，提高葡萄酒安全性[11]。此外，S.pombe可以增加酒體的香氣化合物，改善葡萄酒的復(fù)雜性[12]。據(jù)報道，S.pombe已經(jīng)被用于工業(yè)規(guī)模的朗姆酒生產(chǎn)、棕櫚酒生產(chǎn)、可可發(fā)酵、啤酒釀造和蘋果果酒釀造等[13]。因此，研究S.pombe在葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛力具有非常重要的意義。

黑比諾喜歡溫和或冷涼的氣候，釀造的葡萄酒優(yōu)雅細膩，具有豐富的花果香氣。西北產(chǎn)區(qū)因其獨特的氣候條件(晝夜溫差較大，氣溫偏低)，釀酒葡萄成熟時間較短，成品酒酸度過高、香氣復(fù)雜性欠缺[14]。為此，本實驗以賀蘭山東麓青銅峽市西鴿酒莊黑比諾葡萄為原料，采用S.pombe單獨接種發(fā)酵及與S.cerevisiae同時接種或順序接種發(fā)酵，檢測其發(fā)酵過程中蘋果酸、生物胺等理化指標的變化，測定發(fā)酵后的揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量，研究S.pombe的不同接種方式對黑比諾干紅葡萄酒品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

黑比諾葡萄，采摘于賀蘭山東麓青銅峽市西鴿酒莊葡萄種植基地，糖含量為226.8 g·L-1(以還原糖計)，可滴定酸含量為6.8 g·L-1(以酒石酸計)，pH值為3.67。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

商業(yè)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)，紅佳釀Vintage Red，購于意大利Enartis公司；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe，S.pombe)，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒微生物實驗室保藏；商業(yè)酒酒球菌(Oenococcusoeni)，OMEGA，購于法國Lallemand公司。

YPD固體培養(yǎng)基：無水葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，瓊脂10 g·L-1。YPD液體培養(yǎng)基：無水葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1。葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄汁與無菌水為1∶1(體積比)。所有培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

果膠酶，EX-V，法國Lallemand公司；2-辛醇(色譜純)購于SIGMA-ALDRICH(上海)貿(mào)易有限公司；偏重亞硫酸鈉、L-蘋果酸(色譜純)、L-乳酸(色譜純)等均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國Thermo Scientific公司；TRACE 1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵試驗

菌株活化：1)將商業(yè)活性干酵母S.cerevisiae按0.2 g·L-1添加量置于無菌水中，37 ℃水浴30 min后接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)48 h后以2%的接種量接種于葡萄汁培養(yǎng)基中擴培2次后進行接種試驗。2)將保藏在斜面培養(yǎng)基上的S.pombe接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，再以2%的接種量接種于葡萄汁培養(yǎng)基中，于28 ℃再培養(yǎng)48 h后進行接種試驗。3)將商業(yè)酒酒球菌OMEGA活性干粉按0.02 g·L-1添加量置于無菌蒸餾水中，于30 ℃活化20 min。

發(fā)酵工藝：黑比諾葡萄→除梗破碎→裝罐(添加40 g·L-1SO2，20 mg·L-1果膠酶)→15 ℃培養(yǎng)箱中浸漬48 h，皮渣分離→葡萄汁分裝→65 ℃水浴20 min→冷卻→25 ℃接種酵母進行酒精發(fā)酵(當還原糖低于4 g·L-1時，添加50 mg·L-1SO2終止發(fā)酵，滿罐于15 ℃下貯存。)

4種發(fā)酵接種處理(均進行3次重復(fù))：1)S.cerevisiae單獨接種發(fā)酵(細胞濃度為107CFU·mL-1)，酒精發(fā)酵結(jié)束后進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，為對照組，標記為SC+MLF；2)S.pombe單獨接種發(fā)酵(細胞濃度為107CFU·mL-1)，標記為SP；3)S.pombe與S.cerevisiae細胞濃度比為1 000∶1接種發(fā)酵(細胞濃度分別為107CFU·mL-1、104CFU·mL-1)，標記為SP+SC；4)S.pombe提前S.cerevisiae8 d接種(細胞濃度均為107CFU·mL-1)，標記為SP..SC。3個處理組(SP、SP+SC、SP..SC)酒精發(fā)酵結(jié)束后均不進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵。

1.3.2 指標測定

理化指標測定：1)總糖、總酸、酒精度和揮發(fā)酸等理化指標參照國家標準GB/T 15038—2006中的方法進行測定；單寧參照農(nóng)業(yè)標準NY/T 1600—2008中的方法；總花色苷參照史肖等[15]的方法。2)柔和指數(shù)=酒精-(酸度+單寧)[16]，其中酒精用體積百分數(shù)表示，單寧用g·L-1表示，酸度用g·L-1表示(以硫酸計)。3)色度色調(diào)參照李素岳[17]的方法。準確吸取酒樣1 mL，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，取稀釋后的酒樣于1 cm光程比色皿中，分別在420，520和620 nm下測定吸光度值，色度值(V1)和色調(diào)值(V2)的計算公式如下：

V1=D420+D520+D620；

(1)

V2=D420/D520。

(2)

蘋果酸的測定：參照Buglass等[18]和Pérez-Ruiz等[19]的方法，采用高效液相色譜(HPLC)法測定，并略作修改。1)色譜條件：色譜柱為BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器為二極管陣列檢測器；流動相為0.005 mol·L-1的硫酸水溶液；流速0.5 mL·min-1；柱溫為30 ℃進樣量20 μL；檢測波長為210 nm。2)定性：將配好的蘋果酸、乳酸單一標準溶液分別進樣，確定各自的出峰時間，根據(jù)保留時間進行定性。3)定量：將配好不同濃度的蘋果酸和乳酸混合標準液分別進樣，進行定量分析。以不同混合酸標準液的濃度為自變量(x)，出峰面積為因變量(y)繪制標準曲線，得到蘋果酸的標準曲線方程為y=11.694x+0.027 6，R2=0.999 8；乳酸標準曲線方程為y=10.768x+0.035 5，R2=0.999 7。

組胺與氨基甲酸乙酯測定：分別參照GB 5009.208—2016、GB 5009.223—2014中的方法測定。

1.3.3 揮發(fā)性香氣化合物測定

按照本實驗室優(yōu)化的方法進行。

香氣物質(zhì)富集：取8 mL酒樣于頂空瓶中，加入2.4 g NaCl及10 μL內(nèi)標物2-辛醇(88.2 mg·L-1)，加轉(zhuǎn)子密封，置于磁力攪拌器上，40 ℃下水浴平衡30 min后用50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)的萃取頭頂空萃取30 min。

GC-MS條件：TG-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)；升溫程序為40 ℃保持5 min，以5 ℃·min-1升至230 ℃，保持10 min；載氣(He)流速1 mL·min-1；不分流進樣；電子電離源；電子能量70 eV；進樣口溫度、傳輸線溫度、離子源溫度均為250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～450。

定性分析：GC-MS分析所得的樣品質(zhì)譜圖經(jīng)計算機在NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫檢索比對，結(jié)合譜圖分析，確定揮發(fā)性香氣物質(zhì)的化學(xué)成分。

定量分析：各成分的含量采用內(nèi)標法進行半定量，計算樣品中各香氣組分的含量。

1.3.4 感官分析

由10位葡萄酒品嘗員進行感官評價，分別從外觀(顏色、澄清度)、口感(酸度、甜味、苦味)、香氣(濃郁度、純正度、還原味、氧化味)和總體評分四個方面對各葡萄酒樣品進行評價，使用10分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化，從0(無)到10(優(yōu))對10個指標進行評分。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。使用SPSS 19.0繪制主成分分析圖，并對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，采用Duncan檢驗兩兩比較，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程分析

圖1為不同接種方式發(fā)酵過程中的總糖消耗曲線。結(jié)果顯示，處理組的發(fā)酵速度比對照組低。其中S.pombe與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵速度最低(SP..SC)，于第18天完成酒精發(fā)酵，而S.pombe單獨接種發(fā)酵與S.cerevisiae同時接種發(fā)酵分別在第14、16天完成酒精發(fā)酵(SP、SP+SC)。表明，SP、SP+SC和SP..SC都具一定的酒精發(fā)酵能力，該結(jié)果與前期有關(guān)S.pombe具有良好的乙醇發(fā)酵能力的研究結(jié)果一致[20]。

圖1 發(fā)酵過程中總糖變化曲線

2.2 不同接種方式對葡萄酒品質(zhì)的影響

2.2.1 主要理化指標的測定

表1顯示了不同接種方式發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒的基本理化指標。4種酒樣的殘?zhí)呛吭?.01～3.86 g·L-1，表明各試驗酒樣都能夠完成酒精發(fā)酵；各試驗組的酒精體積分數(shù)介于11.20%～12.10%；處理組酒樣中總酸含量顯著低于對照組，降低量在0.32～2.19 g·L-1，試驗酒樣的揮發(fā)酸含量沒有顯著差異。以上4個指標均符合國標GB 15037—2006對干紅葡萄酒的要求。與對照組相比，處理組的pH值均有一定的增加，在4.00～4.19；經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵的對照組酒樣中乳酸含量(0.99 g·L-1)顯著高于處理組(P<0.05)，但各處理組之間無顯著差異(P>0.05)。單寧是影響葡萄酒質(zhì)量的重要組成部分，賦予了葡萄酒獨特的感官品質(zhì)(收斂性)，其含量與葡萄酒品質(zhì)密切相關(guān)[21]。處理組酒樣中的單寧含量與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。處理組酒樣的色度值、色調(diào)值和總花色苷含量與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。SP..SC的酒樣柔和指數(shù)與對照組和其他處理組之間差異顯著(P<0.05)，其值為6.87，柔和指數(shù)介于6～7，表明紅葡萄酒豐滿圓潤，口感平衡[16]。綜上所述，S.pombe和S.cerevisiae順序接種發(fā)酵的葡萄酒，能夠降低總酸的含量，增加葡萄酒的柔順程度。

表1 不同接種方式下葡萄酒的理化指標變化

2.2.2 不同接種方式對葡萄酒蘋果酸的影響

由圖2可知，對照組單獨接種釀酒酵母S.cerevisiae進行酒精發(fā)酵，蘋果酸含量下降了21.05%，與其他研究結(jié)果一致[22-23]，酒精發(fā)酵結(jié)束后進行的蘋果酸-乳酸發(fā)酵，使蘋果酸迅速下降至0.15 g·L-1。處理組蘋果酸含量主要在發(fā)酵的前6 d迅速下降，酒精發(fā)酵結(jié)束后蘋果酸幾乎被完全降解，但處理組之間沒有明顯差異，含量為0.04～0.05 g·L-1，下降了95.49%～96.99%。許多研究也表明，根據(jù)所使用的S.pombe菌株不同，其蘋果酸含量下降幅度在75%～100%[24]。表明，S.pombe菌株在葡萄酒中可以明顯降低葡萄酒中蘋果酸含量。

圖2 不同接種方式對蘋果酸含量的影響

2.2.3 不同接種方式對葡萄酒生物胺的影響

葡萄酒發(fā)酵過程中含氮化合物不完全代謝會生成氨基甲酸乙酯和組胺等生物胺，這是葡萄酒中重要的安全風(fēng)險因子[25]。在對組胺和氨基甲酸乙酯進行檢測時，未檢測到氨基甲酸乙酯(表2)。所有發(fā)酵組中組胺的最終水平均低于目前的限量標準2 mg·L-1。處理組葡萄酒中組胺的含量顯著低于對照組中組胺含量，其中SP..SC的組胺含量顯著低于SP和SP+SC(P<0.05)，為0.14 mg·L-1。以上結(jié)果表明，使用S.pombe進行葡萄酒發(fā)酵時，可以提高葡萄酒的安全性。

表2 不同接種方式對組胺和氨基甲酸乙酯含量的影響

2.3 不同接種方式對葡萄酒主要香氣化合物的影響

香氣是葡萄酒感官品質(zhì)的重要方面。通過頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對試驗酒樣香氣物質(zhì)進行檢測分析，共檢出78種主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)。包括22種醇類，26種脂類，14種酸類，9種萜烯類，7種其他類。

由圖3可知，SC+MLF共檢出45種香氣物質(zhì)，SP共檢出46種香氣物質(zhì)，SP+SC共檢出62種香氣物質(zhì)，SP..SC共檢出78種香氣物質(zhì)。醇類物質(zhì)是酵母代謝的次級產(chǎn)物之一，是葡萄酒中主要的香氣物質(zhì)，根據(jù)其在葡萄酒中組成和含量的不同，可能賦予葡萄酒怡人的花香和果香等氣味[26]。SP、SC+MLF中醇類物質(zhì)含量顯著低于SP+SC、SP..SC，其中SP..SC醇類物質(zhì)含量最高，為3 590.6 μg·L-1。酯類是葡萄酒通過酯化反應(yīng)產(chǎn)生，也是酵母的代謝產(chǎn)物，能夠為葡萄酒帶來果香味[27]。SP中酯類物質(zhì)含量顯著低于對照組和其他處理組，但SP+SC、SP..SC和對照組之間沒有顯著差異，其中SP..SC酯類物質(zhì)含量最高，為5 358.32 μg·L-1。葡萄酒中的酸類一般是酵母菌和乳酸菌代謝產(chǎn)生，具有腐敗和奶酪的氣味[27]。SP、SP+SC、SP..SC中酸類物質(zhì)含量顯著低于SC+MLF，其中SP中酸類物質(zhì)含量最低，為1 115.35 μg·L-1。葡萄酒中的萜烯類物質(zhì)感官閾值低，這類物質(zhì)具有濃郁的香味，對葡萄酒的香氣有很大的積極貢獻。SP+SC、SP..SC中萜烯類物質(zhì)含量顯著高于SP、SC+MLF，其中SP+SC、SP..SC中萜烯類物質(zhì)含量分別為47.35 μg·L-1和46.31 μg·L-1。不同接種方式下的葡萄酒中其他類物質(zhì)含量沒有顯著差異，且含量相對較低。上述結(jié)果表明，S.pombe與S.cerevisiae同時和順序接種發(fā)酵能夠增加葡萄酒中酯類、醇類和萜烯類物質(zhì)的總量和種類。

柱形圖表示香氣物質(zhì)含量，折線圖表示香氣物質(zhì)數(shù)量。不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

氣味活性閾值(odor activity value，OAV)是評價單一香氣化合物對整體香氣的貢獻程度[28]。為進一步確定各種香氣物質(zhì)對葡萄酒香氣的貢獻大小，本試驗將OAV>1的物質(zhì)歸為關(guān)鍵性香氣物質(zhì)。由表3可知，共有16種關(guān)鍵性香氣物質(zhì)，其中S.pombe與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵產(chǎn)生的關(guān)鍵性香氣物質(zhì)最多共8種，S.cerevisiae單獨發(fā)酵的為7種，S.pombe與S.cerevisiae同時接種發(fā)酵的為7種，S.pombe單獨發(fā)酵的為3種。

表3 關(guān)鍵性香氣物質(zhì)的OAV

由于葡萄酒香氣成分復(fù)雜，為明確各個酒樣的香氣成分差異，將16種OAV >1的香氣物質(zhì)進行主成分分析(principle compounds analysis，PCA)。由圖4可知，兩個主成分(PC1和PC2)分別占總體方差的44.07%和42.81%，二者累計貢獻率達到86.88%。SC+MLF位于PC1的正向端，與丁酸乙酯、辛酸甲酯、丁香酚、乙酸異戊酯等香氣物質(zhì)相關(guān)性強，能夠為葡萄酒帶來比較濃郁的果香、花香等氣味，但也與己酸的相關(guān)性較強，會為葡萄酒帶來脂肪味等不良氣味；SP..SC位于PC2的正向端，與正戊醇、辛酸乙酯、己酸乙酯、苯乙醇、癸酸乙酯、香茅醇等香氣物質(zhì)具有緊密聯(lián)系，能夠為葡萄酒帶來濃郁的花香、果香等氣味；SP、SP+SC與月桂酸乙酯、庚酸乙酯、庚醇的相關(guān)性較強，月桂酸乙酯和庚酸乙酯能夠為葡萄酒帶來怡人的花香和果香，而庚醇為葡萄酒帶來了油膩味等不良氣味。相比之下，S.pombe和S.cerevisiae順序接種發(fā)酵的葡萄酒產(chǎn)香性能優(yōu)于對照組和其他處理組，并且產(chǎn)脂類、醇類物質(zhì)能力最強。

圖4 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖(A)和樣品分布圖(B)

2.4 感官分析

對不同接種發(fā)酵方式的葡萄酒進行感官分析(圖5)。與對照組相比，3種不同的接種方式進行酒精發(fā)酵后的葡萄酒在澄清度、顏色、還原味等方面沒有明顯的差異；S.cerevisiae單獨接種發(fā)酵后進行的蘋果酸-乳酸發(fā)酵為葡萄酒帶來了強烈的氧化味、酸味和苦味，處理組酒樣的氧化味、酸味和苦味明顯低于對照組，SP..SC的葡萄酒的酸味明顯低于SP和SP+SC，處理組葡萄酒的氧化味和苦味之間沒有明顯差異。SP..SC的酒樣在總體評分方面得到了最高的分數(shù)，酒樣口感柔和，香氣濃郁，具有良好的感官品質(zhì)。上述結(jié)果表明，S.pombe與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵的葡萄酒感官評價最優(yōu)。

圖5 感官分析雷達圖

3 結(jié)論

以黑比諾葡萄為原料，采用S.pombe單一菌株接種發(fā)酵及與S.cerevisiae同時或順序接種發(fā)酵進行干紅葡萄酒釀造時，其殘?zhí)?、酒精度、總酸和揮發(fā)酸均符合國標GB 15037—2006《葡萄酒》對干紅葡萄酒的要求；與對照組相比，其葡萄酒均能夠完成酒精發(fā)酵，且能夠顯著降低葡萄酒中蘋果酸和組胺的含量；其中，S.pombe與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵的葡萄酒中蘋果酸和組胺含量明顯低于對照組和其他處理組。S.pombe與S.cerevisiae同時和順序接種發(fā)酵與對照組相比，均能夠明顯增加葡萄酒中的醇類、酯類和萜烯類物質(zhì)的總量和種類，使葡萄酒中具有濃郁的果香和花香。通過感官評價發(fā)現(xiàn)，S.pombe和S.cerevisiae順序接種發(fā)酵能夠增加葡萄酒的香氣，改善葡萄酒口感。綜上所述，S.pombe單一菌株接種及與S.cerevisiae同時或順序接種時，S.pombe和S.cerevisiae以順序接種方式發(fā)酵能夠明顯增加酒體中醇類、酯類和萜烯類物質(zhì)含量，降低蘋果酸含量，在一定程度能夠提升葡萄酒的感官品質(zhì)，具有潛在的應(yīng)用價值。