陳夢竹，康振亞，郭向輝，耿 毅，*，白明煥，歐陽萍，陳德芳，黃小麗，賴為民

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都611130；2.自貢市疾病預防控制中心，四川 自貢 643000；3.四川農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，四川 成都 611130)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，隸屬弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭氏陰性桿菌，被認為是條件致病菌，可感染草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鱖、青魚、羅非魚、黃顙魚、金魚、黃鱔、鱉、蝦、蟹、牛蛙等多種水生動物，甚至引起大范圍的爆發(fā)性流行，造成巨大的經(jīng)濟損失[1-5]；同時也對人類健康造成威脅，尤其是食用未煮熟的污染水產(chǎn)品或者接觸帶菌的生魚都有感染的風險[6-9]，該菌可引起人類敗血癥、眼球炎、嘔吐、腹瀉、毛囊炎[10]等。

巖原鯉(Procyprisrabaudi)，隸屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)原鯉屬(Procypris)，因棲息巖石間穴的習性而得名，是長江上游特有魚類和重要經(jīng)濟魚類，為中國特有物種。巖原鯉的種群資源因長江上游水電開發(fā)、過度捕撈與其他人類活動的影響而嚴重衰退，已達三級急切保護動物[11]，為四川省重點保護魚類[12]。巖原鯉因其肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，適合在池塘等水體規(guī)模養(yǎng)殖的特點，被四川省列為名優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖推廣品種。2020年7月，宜賓某養(yǎng)殖場的巖原鯉突發(fā)死亡，表現(xiàn)為體表多處出血，內(nèi)臟充血、出血，發(fā)病魚死亡率達80%以上；發(fā)病時主要水質(zhì)指標為：水溫26～28 ℃，pH 7.6～8.0，溶氧量2.8 mg·L-1，亞硝酸含量0.1 mg·L-1，氨氮0.02 mg·L-1。本研究從病魚體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢病原菌，經(jīng)鑒定其為嗜水氣單胞菌，同時進行了其半數(shù)致死量(LD50)、耐藥性、毒力基因與多位點序列分型(MLST)等生物學特性的研究，以期為有效防控該菌引起的感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病巖原鯉來自四川宜賓某養(yǎng)殖場，體長約(26.8±1.2)cm，體重(485.3±16.8)g，健康巖原鯉體長(7.8±1.5)cm，體重為(12.6 ± 0.8)g。DNA提取試劑盒購自北京天根生化有限公司?？咕幟艏埰徸院贾菸⑸镌噭┯邢薰尽Ｒ锖铣膳c基因序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。2 × RapidTaqMaster mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 臨床癥狀與病原菌的分離

觀察記錄送檢患病巖原鯉的臨床癥狀，檢查有無體外寄生蟲；用75%乙醇擦洗體表，在無菌條件下進行解剖，從肝、腎取樣，劃線接種腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，純化，觀察分離細菌的生長情況與菌落特征。

1.3 分離菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察與生化鑒定

取純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細菌形態(tài)。使用法國梅里埃VITEK 2 compact全自動微生物鑒定儀測定細菌生理生化特性。

1.3.2 16S rDNA分析

將菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h，取1.5 mL菌液于離心管，利用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。采用16S rDNA通用引物[13](F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGCTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增，55 ℃退火。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將純化回收的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將獲得的分離菌16SrDNA在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，使用MEGA-X用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 致病性試驗

將分離到的病原菌接于腦心浸液(brian heart infusion，BHI)培養(yǎng)基，用0.65%無菌NaCl溶液洗脫菌落，稀釋成濃度為5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104CFU·mL-1的菌懸液。每組試驗魚為12尾，攻毒劑量為每尾0.1 mL，對照組注射等量0.65%無菌NaCl溶液，水溫在(24±1)℃，pH值 6.7～7.0，攻毒后連續(xù)觀察14 d，記錄魚的發(fā)病和死亡情況，對上述感染死亡的魚再次進行致病菌分離鑒定，并利用寇式改良法計算半數(shù)致死量[14]。

1.5 藥物敏感性測定

按美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)制定的抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，采用紙片擴散法測定菌株YYL對20種藥物的敏感性。28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑，判定菌株對藥物的敏感性[5，15]。

1.6 多位點序列分型

根據(jù)Martino等[16]的研究結(jié)果，選擇6個管家基因(gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA)擴增片段進行MLST分析，相關引物序列與退火溫度見表1。反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，退火15 s(溫度見表1)，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測得序列拼接后上傳至http://pubmlast.org/organisms/aeromonas數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中序列進行MLST分析，得到每個管家基因的等位基因型(ST)，再將該ST型上傳至phyloviz軟件分析進化關系。

表1 管家基因引物序列

1.7 毒力基因檢測

嗜水氣單胞菌aerA、hlyA、aphA、act、ast、ascV毒力基因引物序列[1，16-18]見表2，PCR產(chǎn)物回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，上傳至NCBI比對。

表2 毒力基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

患病巖原鯉鰓蓋、下頜、腹部、鰭基部明顯充血、出血、發(fā)紅，肛門紅腫，擠壓腹部從肛門流出大量含血液體(圖1-A)；鰓絲蒼白，鰓絲基部淤血，鰓絲與體表黏液鏡檢未發(fā)現(xiàn)寄生蟲；腹腔內(nèi)含一定量紅色腹水，腸道擴張(圖1-B)，其內(nèi)充有大量黏液，肝和腎腫大、淤血(圖1-B、1-C)。

A，病魚體表多處充血、出血，肛門流出含血液體；B，腸道擴張，充滿黏液(▲)，肝腫大(●)，淤血；C，腎腫大，淤血。

2.2 病原的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察

從患病巖原鯉的肝、腎分離到菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢菌，在BHI培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，菌落直徑1～2 mm，菌落呈半透明的淡黃色圓形，邊緣整齊、表面濕潤、隆起、光滑，菌體為革蘭氏陰性短桿菌(圖2)，將分離菌株命名為YYL。

圖2 菌株YYL革蘭氏染色形態(tài)

2.3 分離菌的鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

經(jīng)過VITEK 2 compact全自動微生物鑒定儀與革蘭陰性菌鑒定卡(GN)測定，該菌可分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖等多種碳源，但不可利用纖維二糖，可產(chǎn)生H2S，無鳥氨酸脫羧酶，其余各項生理生化特性見表3，初步鑒定菌株YYL為嗜水氣單胞菌，其可信度為99%。

表3 VITEK 2 compact細菌鑒定系統(tǒng)測定菌株YYL的生理生化特性

2.3.2 16S rDNA分析

將菌株16S rDNA測序結(jié)果上傳NCBl網(wǎng)站，取得登錄號MW116379?；虮葘Y(jié)果顯示，其與嗜水氣單胞菌的同源性最高(99%)。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示，菌株YYL與嗜水氣單胞菌聚為一簇。綜合分離菌YYL的形態(tài)學特征、生理生化特性與16S rDNA分析，將分離菌YYL鑒定為嗜水氣單胞菌。

圖3 基于菌株YYL與其他菌株的16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 致病性

動物感染試驗發(fā)現(xiàn)，對照組巖原鯉在觀察期內(nèi)無明顯癥狀和死亡現(xiàn)象，攻毒組于18 h后開始出現(xiàn)厭動、對外界刺激反應遲鈍等表現(xiàn)，高濃度攻毒組(5.0×108CFU·mL-1)在感染12 h后開始死亡。試驗結(jié)束時各組巖原鯉死亡情況見表4。剖檢死魚，發(fā)現(xiàn)與自然發(fā)病魚的癥狀相似(圖4)：鱗片脫落，鰭基部出血，肛門紅腫，腹腔內(nèi)有血色腹水，腎腫大，腸道擴張，腸腔內(nèi)多量黏液；并從死魚肝和腎重新分離得到原接種細菌。根據(jù)寇氏改良法計算LD50為5.8×104CFU·g-1。

A，攻毒魚體表鱗片脫落，鰭基部出血；B，腎腫大(●)，腹腔內(nèi)紅色腹水(▲)，腸道擴張，腸腔充滿黏液。

表4 菌株YYL對健康巖原鯉人工感染試驗結(jié)果

2.5 藥物敏感性

如表5所示，該菌對頭孢他定、頭孢西丁、慶大霉素、萘啶酸、鏈霉素、卡娜霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考敏感；對四環(huán)素、妥布霉素、多黏菌素B中度敏感；對亞胺培南、羅紅霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑、克林霉素耐藥。

表5 菌株YYL的藥物敏感性

2.6 MLST分型

分別用嗜水氣單胞菌gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA管家基因的特異性引物進行PCR擴增后，經(jīng)測序拼接序列后上傳http://pubmlast.org/ogranisms/aeromonas數(shù)據(jù)庫。結(jié)果表明，6個管家基因的等位基因分別為：122、214、210、211、221、217，屬ST-251型。上傳phyloviz比較發(fā)現(xiàn)，該ST型由ST-366發(fā)生單一位點或多位點突變(或重組)而來，與ST-134親緣關系較近(圖5)。

圖5 菌株YYL在氣單胞菌ST型中的位置

2.7 毒力基因檢測

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)，菌株YYL同時攜帶aerA、hlyA、aphA、act、ast共5個毒力因子基因，未攜帶ascV毒力因子基因(圖6)，從分子水平上說明該菌株具有較強的致病性，與人工回歸感染結(jié)果相一致。

1，aphA; 2，hlyA;3，ascV; 4，aerA; 5，ast; 6，act; M，DL 2000 marker.

3 結(jié)論與討論

隨著巖原鯉人工繁殖和養(yǎng)殖技術的成熟[19]，其養(yǎng)殖快速發(fā)展，并成為四川省特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，但諸如小瓜蟲、杯體蟲、腸炎病、爛鰓病等[19-20]疾病的頻發(fā)也制約了巖原鯉養(yǎng)殖的持續(xù)健康發(fā)展。本研究所報道病例以體表出血為特征，發(fā)病魚死亡率達80%以上，從發(fā)病巖原鯉體內(nèi)分離到嗜水氣單胞菌。嗜水氣單胞菌是嚴重危害水生動物的條件致病菌，一旦感染發(fā)病往往導致嚴重的經(jīng)濟損失，因此，在巖原鯉養(yǎng)殖中應對該菌的感染予以重視。

本研究中分離的嗜水氣單胞菌YYL株在MLST分子分型中屬ST-251型，攜帶aerA、hlyA、aphA、act、ast等5個毒力因子基因，對巖原鯉的LD50為5.8×104CFU·g-1，致病力較強。有研究表明，ST-251型菌株相比于其他型菌株攜帶的毒力因子更多[21]，具有aerA、hlyA、aphA毒力基因的菌株毒力更強[17，22]。自1989年以來，嗜水氣單胞菌感染被認為是嚴重危害我國鯉科魚類的疫病之一，給我國鯉科魚類造成巨大的經(jīng)濟損失。有研究發(fā)現(xiàn)，在我國中部(武漢、長沙等)嗜水氣單胞菌主要為ST-251型[23-24]；江蘇南京地區(qū)嗜水氣單胞菌的主要流行菌株也為ST-251型[25]。鑒于ST-251型嗜水氣單胞菌的流行范圍廣、毒力強、危害性大，應加強ST-251型嗜水氣單胞菌的流行病學與防控研究，以有效控制其對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物健康的威脅。

根據(jù)藥物敏感性結(jié)果，本次病例中推薦使用氟苯尼考+多西環(huán)素(強力霉素)內(nèi)服治療，同時使用聚維酮碘進行環(huán)境消毒殺菌，病情得到迅速控制。研究表明，隨著抗菌藥物的大量使用或濫用，菌株耐藥性會不斷增強，嗜水氣單胞菌臨床分離株的多重耐藥情況日益嚴峻，對氨芐西林和頭孢噻吩的耐藥率在96%以上(多數(shù)可達100%)，對阿莫西林、四環(huán)素、復方新諾明、氟苯尼考等常用藥物均表現(xiàn)出嚴重的耐藥[26-27]。因此，對于嗜水氣單胞菌感染的治療應在藥敏試驗的指導下正確合理地選用抗生素類藥物，避免藥物濫用，造成耐藥性增強。

嗜水氣單胞菌作為一種條件致病菌，廣泛存在于水體環(huán)境中，水質(zhì)變化、應激條件下的易感動物、機械損傷等多種因素對其感染風險都具有重要影響。有研究表明，溫度、pH值、分子氨和亞硝酸鹽等多因子的變化顯著影響魚體生長和抗病力，同時也對嗜水氣單胞菌的致病力有明顯影響[28-29]。陸春云等[28]發(fā)現(xiàn)，對團頭魴感染嗜水氣單胞菌后存活時間影響的大小為溫度>pH值>亞硝酸鹽>分子氨，且在一定范圍內(nèi)，嗜水氣單胞菌的致病力隨著溫度(20～32 ℃)的升高而增強，隨著pH值(6.5～8.0)的升高而減弱；Sautour等[30]發(fā)現(xiàn)，水體溫度與流動性顯著影響了嗜水氣單胞菌的生長狀態(tài)。因此，在養(yǎng)殖過程中應加強水質(zhì)的監(jiān)測與調(diào)控，以免形成嗜水氣單胞菌生長的溫床，同時可使用甘露寡糖、維生素C、維生素E等免疫增強劑[31-32]，提高養(yǎng)殖魚類免疫力，從而降低發(fā)病風險。

4 結(jié)論

本研究首次從以體表出血為特征的患病巖原鯉分離到具有高致病性的ST-251型嗜水氣單胞菌，在巖原鯉的養(yǎng)殖中對該菌感染的預防與控制應予以重視，以降低其對巖原鯉養(yǎng)殖的危害。