付海洋 李 敏,2 于 浩,2 付步芳 王召旭

1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所，北京 102629；2.煙臺大學生命科學院，山東煙臺 264000

近年來血管支架從材料到工藝都在不斷優(yōu)化發(fā)展，為了能夠更好地評價這類醫(yī)療器械的性能，各種評價方法不斷發(fā)展[1-4]。傳統(tǒng)的動物實驗是目前主要評價手段，但該類方法耗時長、影響因素過多。體外組織學評價具有細胞評價和動物評價不可替代的特點，比如其既可模擬動物體內的生理環(huán)境和流體力學環(huán)境，又可通過設置參數(shù)、添加試劑成分控制各種條件，以探究各種因素所產(chǎn)生的作用。但目前體外組織學評價研究受限于體外血管組織培養(yǎng)，發(fā)展緩慢，面臨的難點主要是在保證無污染血管長期存活的基礎上維持血管的組織結構和生理功能[5-8]。本研究主要旨在解決兩個問題：一是如何實現(xiàn)長期無污染培養(yǎng)，二是研究應力對血管結構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康新西蘭家兔3 只，體重2.5～3.0 kg，SPF 級，性別不限，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0017 號，實驗動物合格證號：NO.110317201100 0144，倫理號：中檢動（福）第2019（A）054 號。

1.2 試劑

MEM 培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；青鏈霉素雙抗溶液（Gibco）；Masson 染色試劑盒（Solarbio）；10%三氯化鐵水溶液（上海銘博生物）；1%碘液（Solarbio）。

1.3 儀器

BOSE ElectroForce 5200 BioDynamic 生物反應器。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組 每只新西蘭家兔取兩側頸動脈，各長8～10 cm，取2 cm 做靜態(tài)培養(yǎng)對照，另外各取3～4 cm（其中2 cm 用于檢測，兩頭多出部分用于固定）做25、50、80 ml/min 動態(tài)培養(yǎng)，每組重復3 次。以下簡稱靜態(tài)組、25 組、50 組、80 組。

1.4.2 獲取血管 獲取家兔兩側頸動脈，用PBS 緩沖液輕柔沖洗2～3 次至無殘留血液。

1.4.3 參數(shù)設置 如圖1 所示組裝生物反應器，箭頭所示為液體流動方向，血管放置于反應艙內。模擬兔子的心跳頻率調節(jié)脈動泵的位移頻率為3 Hz/s；模擬兔子血管內的收縮壓100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），舒張壓95 mmHg 調節(jié)脈沖泵的位移。調節(jié)蠕動泵，控制培養(yǎng)基流速分別為25、50、80 ml/min。

圖1 生物反應器示意圖

1.4.4 血管染色和觀察 培養(yǎng)結束后用10%甲醛固定血管24 h 以上。制備切片行HE、EVG、Masson 染色，并用顯微鏡觀察內外膜、彈性纖維、膠原纖維等。

2 結果

2.1 HE 染色

如圖2A，靜態(tài)組0 d 血管形態(tài)正常，內皮細胞完整，內彈力板整齊；圖2B中靜態(tài)組靜態(tài)培養(yǎng)15 d 血管內皮細胞完整，平滑肌細胞排列混亂；圖2C中80 組培養(yǎng)4 d 血管形態(tài)正常，內皮細胞不可見，平滑肌細胞排列混亂且松散，內彈力板清晰；圖2D中80 組培養(yǎng)8 d 與4 d 比較，內側平滑肌細胞排列由混亂變?yōu)檎R；圖2E～F中50 組培養(yǎng)10、15 d 的血管形態(tài)相似，未見內皮細胞，平滑肌細胞排列整齊且細胞核為橢圓狀，呈現(xiàn)增殖狀態(tài)，內彈力板清晰。圖2G～H中25 組培養(yǎng)10 d 和15 d 血管形態(tài)均正常，細胞排列整齊，內皮細胞完整，中膜內彈力板整齊。

2.2 EVG 染色

圖2A靜態(tài)組0 d 血管彈性纖維舒張且有序；圖2B靜態(tài)組靜態(tài)培養(yǎng)15 d 血管中彈性纖維和0 d 比較收縮劇烈；圖2C～D80 組培養(yǎng)4、8 d 血管彈性纖維未見明顯變化；圖2E和圖2G50 組和25 組10 d 血管維持正常狀態(tài)；圖2F和圖2H顯示50 組和25 組培養(yǎng)15 d和14 d 的血管彈性纖維較10 d 明顯疏松且趨于平直，且50 組條件下更為平直。

圖2 染色結果（200×）（見內文第5 頁）

2.3 Masson 染色

靜態(tài)組0 d 膠原纖維均勻分布在整個血管中膜；靜態(tài)組15 d 血管中膠原纖維分布范圍與0 d 基本一致；80 組動態(tài)培養(yǎng)4 d 的血管膠原纖維分布及含量保持較好；80 組培養(yǎng)8 d 血管膠原纖維明顯減少，紅色肌纖維著色增多；50 組和25 組血管膠原纖維變化趨勢與80 組相同，但速度慢。見圖2。

3 討論

本研究中的體外血管培養(yǎng)在生物反應器中進行，該裝置包括血管培養(yǎng)倉、蠕動泵、脈動泵、儲液瓶及監(jiān)測裝置。其復雜的結構，增加了操作的難度和污染的可能，其難點在于在保證無污染血管長期存活的基礎上維持血管的組織結構和生理功能[9-10]。1995 年Nathalie Bardy 等設計了一種體外培養(yǎng)模型，加載不同的流量和流速，血管存活了8 d，但整體裝置較為簡單，不能模擬血流的周期性脈動[11]。2001 年，劉波等[12]設計了新型的血管體外應力培養(yǎng)系統(tǒng)，對血管施加定常流與脈動流，穩(wěn)定培養(yǎng)豬頸總動脈7 d；2006 年，張海燕[13]為研究冠脈支架再狹窄的機制設計了血管體外培養(yǎng)裝置，模擬了在體時血管內壁剪切力、收縮舒張壓、流體層流等，可做到穩(wěn)定培養(yǎng)7 d 左右；2012 年北京航空航天大學與四川大學聯(lián)合研制了一種雙循環(huán)生物反應器，分別調控剪切力、舒張壓、收縮壓的大小，施加定常流與脈動流，但穩(wěn)定培養(yǎng)時間過短[14]；2019 年和2020 年Post 等[15]和Daum 等[16]分別運用生物反應器對組織工程血管進行了14 d 和7 d 的培養(yǎng)。綜上體外血管組織的培養(yǎng)通常達到7 d，鮮有超過2 周的記錄。本研究通過優(yōu)化實驗程序，改善實驗條件，嚴格的無菌操作等，使得血管在體外動態(tài)培養(yǎng)的時間達到15 d，和目前國內外體外培養(yǎng)的最長時間基本一致。

血管管壁由三層膜構成，最內層為內膜，由平行排列的內皮組成；中膜由多層環(huán)形平滑肌纖維組成；外膜由纖維細胞，縱行的膠原纖維束和薄彈力纖維共同組成[17-18]。新西蘭家兔的血液正常流速為25 ml/min[19]，為了研究高流速對血管結構的影響，本實驗中動態(tài)組設了流速分別為50 ml/min 和80 ml/min 的50 組和80 組，流速加快會造成血管受到的剪切力增大，內皮細胞會變得更細長[20]。本研究中，動態(tài)組血管HE 染色切片中未見到明顯內皮細胞，一方面可能是因為細胞變細長后未切到細胞核，另一方面可能是在取血管時的拉扯損傷了內皮細胞，或高應力環(huán)境導致內皮細胞易脫落。

血管平滑肌細胞的主要功能是調節(jié)血管的口徑、保持血管支撐力，正常應力下保持排列整齊且細胞核為長梭型[21]。靜態(tài)組靜態(tài)培養(yǎng)15 d 由于血管失去應力環(huán)境導致血管平滑肌細胞生長方向變得混亂；應力突然增加導致80 組4 d 平滑肌細胞排列發(fā)生變化，但8 d時血管逐漸適應了新的應力環(huán)境，從外側細胞開始逐漸恢復整齊；50 組出現(xiàn)細胞增殖的情況，可能的原因是內皮細胞受損后，切應力直接作用于平滑肌細胞，引起了細胞增殖與凋亡的失衡[22-23]；25 組內皮細胞和平滑肌細胞基本維持正常狀態(tài)。

彈性纖維是血管的主要功能成分，對維持血管彈性回縮起著重要作用[24]。正常血管的彈力纖維形狀清晰，呈疏松的波浪狀有序排列。靜態(tài)組血管在離體后失去了在體時的壓力、應力、載荷等，隨著培養(yǎng)時間的增長，血管發(fā)生收縮形變，彈性纖維與剛取出時比較呈現(xiàn)收縮狀態(tài)。動態(tài)組固定時保持了在體長度，維持體內應力環(huán)境，不同流速下彈性纖維的形態(tài)基本保持不變，均排列有序，提示本實驗中施加的應力尚在彈性纖維的承受能力范圍內。

膠原纖維為血管提供一定的剛度及強度，與彈性纖維共同維持血管壁的力學功能[25]。膠原纖維的彈性模量比彈性纖維和平滑肌高，是力的主要承擔者。靜態(tài)組血管未受到力的刺激，膠原纖維沒有流失；而動態(tài)組血管處于應力的環(huán)境中，膠原纖維承受力的同時也在慢慢降解，由于離體培養(yǎng)時沒有添加合成膠原纖維的成分，故在培養(yǎng)到15 d 時，膠原纖維降解最為嚴重，呈細絲狀；不同流速的條件下，80 組在培養(yǎng)8 d 時已經(jīng)能夠看出膠原纖維呈細絲狀，而50 組在15 d 時呈現(xiàn)相同狀態(tài)；由此可見，應力越高，膠原纖維降解的速度越快。

本研究在應力條件下體外培養(yǎng)血管15 d，和目前國內外體外培養(yǎng)的最長時間基本一致[25]。結果顯示，在模擬動物體內各參數(shù)的條件下，血管體外動態(tài)培養(yǎng)有助于維持血管的生理結構，但高應力條件下，會導致血管內皮細胞受損，進而造成平滑肌細胞增殖，膠原纖維流失較為嚴重。今后的研究工作應重點關注防污染，延長培養(yǎng)時間；培養(yǎng)過程中及時補充膠原，防止膠原蛋白流失。