張子卉 賈 琪 連朋敬 李靜云 徐 彤 白 玉 李鴻儒 喬 健*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193； 2.河北北方學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

H9N2亞型流感病毒作為傳播最廣的甲型流感病毒，其流行蔓延明顯降低了家禽的生產(chǎn)效率，甚至跨宿主屏障感染人類。截止2019年6月，全球報(bào)道50例人類感染H9N2甲型流感病毒的病例，其中1999—2012年17例，2013年至今28例，呈近年上升趨勢[1]。由于H9N2病毒感染人類的大部分病例癥狀較輕，可能尚存大量沒有發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的H9N2病毒感染病例。一項(xiàng)血清型調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在某些禽類工作者群體中，H9抗體的陽性率高達(dá)15.5%[2]。在世界衛(wèi)生組織(WHO)劃定的流感預(yù)警分級標(biāo)準(zhǔn)中，H9N2病毒被認(rèn)定為2～3級，其具有成為大流行毒株的潛力，因此，需要持續(xù)監(jiān)測和研究[3]。

溫帶地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查表明，甲型流感病毒的爆發(fā)具有季節(jié)性波動(dòng)，在冬季發(fā)病率達(dá)到高峰[4]。有調(diào)查表明，在冬季，溫帶地區(qū)甲型流感導(dǎo)致的住院率和死亡率均大幅增長，冬季最高峰月份發(fā)病率甚至是夏季月份的2倍[5]。因此，一般認(rèn)為甲型流感感染與冷暴露有關(guān)。一項(xiàng)觀察足部急性降溫效果的研究顯示，在4～5 d中，有10%的人出現(xiàn)普通感冒癥狀，這表明寒冷與普通感冒有關(guān)[6]。Eccles[7]認(rèn)為低溫環(huán)境可使鼻子和喉嚨的黏膜血管收縮，從而損害局部免疫反應(yīng)，并使亞臨床病毒感染發(fā)展為臨床感染。但是低溫環(huán)境促進(jìn)病毒感染的假設(shè)是有爭議的。因?yàn)槟承┭芯勘砻?，急性受冷后機(jī)體對呼吸道病毒感染的敏感性并未增加[6,8]。

有研究者認(rèn)為，環(huán)境低溫有助于流感病毒的存活、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及傳播[9-10]。也有學(xué)者認(rèn)為環(huán)境低溫會(huì)損害宿主抗病毒防御，促進(jìn)病毒感染。小鼠在寒冷環(huán)境中經(jīng)歷一段時(shí)間后，病理檢查可觀察到氣管上皮細(xì)胞的病理改變，如上皮增生和白細(xì)胞浸潤等[11]。傅鈺等[12]研究表明寒冷環(huán)境會(huì)通過損傷正常肺組織、改變肺部正常免疫功能以及造成肺部應(yīng)激多個(gè)方面對肺部正常免疫功能造成損害。還有研究發(fā)現(xiàn)，低溫使宿主對病毒的防御減弱，如降低呼吸道粘膜纖毛的擺動(dòng)頻率及通過抑制干擾素誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)降低宿主抗病毒天然免疫[4,13]。以小型哺乳動(dòng)物為試驗(yàn)對象的研究表明，寒冷可能抑制免疫系統(tǒng)的一些細(xì)胞和體液成分[14]。然而，有關(guān)冷暴露對人體免疫功能影響的研究表明，寒冷并未降低免疫功能[15]。

綜上所述，環(huán)境低溫對病毒感染的影響存在爭議，其潛在機(jī)制也未能完全闡明，需要進(jìn)一步深入研究。環(huán)境低溫對甲型流感的影響及其機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究通過H9N2病毒感染建立小鼠肺損傷模型，應(yīng)用環(huán)境低溫處理感染小鼠，觀察感染小鼠發(fā)病14 天內(nèi)的臨床癥狀、存活率，肺臟病變程度、肺部細(xì)胞因子含量的動(dòng)態(tài)變化以及肺臟病毒載量來探討環(huán)境低溫對H9N2病毒感染的影響，將有助于進(jìn)一步了解甲型流感病毒的致病機(jī)理，進(jìn)而采取有效的手段預(yù)防和治療流感感染。

1 材料與方法

1.1 病毒

禽流感A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒，是本實(shí)驗(yàn)室2008年從河北地區(qū)某一養(yǎng)雞廠—患病雞群中分離所得。本實(shí)驗(yàn)室通過分離鑒定確定該毒株為低致病性的H9N2甲型流感病毒，命名為A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)(登錄號為FJ499463-FJ499470)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡，18～22 g雄性SPF BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑

4%多聚甲醛購自北京化學(xué)試劑公司。無水乙醇、二甲苯以及中性樹膠購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。蘇木精、伊紅染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小鼠TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣本采集

BALB/c成年雄性小鼠隨機(jī)分為4組：無感染常溫組、無感染低溫組、H9N2病毒感染常溫組和H9N2病毒感染低溫組，每組30只。本試驗(yàn)主要是通過在冬季開窗、關(guān)閉暖氣、在鼠籠的周圍放置冰袋來達(dá)到低溫處理的要求，試驗(yàn)全程由溫度計(jì)檢測環(huán)境溫度來保證低溫處理的小鼠在溫度(10±2) ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)。將H9N2雞胚尿囊液用無菌PBS稀釋到106EID50。無感染常溫組小鼠滴鼻接種100 μL 無菌PBS，置于(20±2) ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)。無感染低溫組小鼠滴鼻接種100 μL的無菌PBS，置于(10±2) ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)。H9N2病毒感染常溫組小鼠滴鼻接種100 μL的H9N2病毒稀釋液，置于(20±2) ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)。H9N2病毒感染低溫組小鼠滴鼻接種100 μL的H9N2病毒稀釋液，置于(10±2) ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)(表1)。

每天在固定時(shí)間觀察小鼠臨床癥狀，監(jiān)測小鼠體重和采食量的變化，觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)和死亡情況。在病毒感染后第2、5、7和14 天每組隨機(jī)取5只小鼠，稱重，麻醉后脫頸處死，采集肺臟并稱重，計(jì)算肺系數(shù)(肺系數(shù)=肺濕重/體重×100%)，觀察記錄肺臟大體病理變化。

表1 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)Table 1 Experiment grouping design

1.5 肺組織病理切片的制作及HE染色

在病毒感染后第2和5天，采取各組肺組織，將肺組織在4%多聚甲醛溶液中固定一周后，經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、蘇木素-伊紅染色、封片步驟，制作組織切片并觀察。

1.6 ELISA法測定肺組織勻漿中TNF-α和IL-1β的含量

在病毒感染后2和5天，采取各組肺組織，將肺組織在0.6 mL PBS中研磨，獲得肺組織勻漿。并以5 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行檢測。按照小鼠TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)在GraphPad Prism8上擬合曲線并計(jì)算待測樣品含量。

1.7 肺組織病毒載量的測定

使用病毒噬斑測定法測定肺組織病毒載量。在病毒感染后2和5天，采取各組肺組織，將肺在1.1 mL PBS中研磨，并以10 000 r/min離心10 min以收集上清液。使用0.22 μm濾膜過濾上清液以去除細(xì)菌。使用重懸于含10%FBS的DMEM中的MDCK細(xì)胞，通過病毒噬斑測定法測定病毒滴度。將稀釋的上清液添加到MDCK單細(xì)胞層中1 h。移除接種物，并將含有TPCK-胰蛋白酶(1 μg/mL)的低熔點(diǎn)1%瓊脂糖的混合物添加至MDCK單細(xì)胞層上。72 h后，將板用4%甲醛處理20 min，然后移除瓊脂糖。用2%結(jié)晶紫干燥噬斑15 min，然后計(jì)數(shù)病毒噬斑。PFU/mL=病毒噬斑數(shù)×稀釋比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用t檢驗(yàn)分析兩組間差異性，AVONA分析多組間差異性，P>0.05為顯著不差異，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理的小鼠存活率及臨床癥狀

無感染常溫和低溫組小鼠存活率均為100%，H9N2感染常溫組小鼠在感染后第1天死亡1只小鼠，最終死亡率為95%。H9N2感染低溫組在感染后第3和5天各死亡3只和2只小鼠，最終死亡率為67%(圖1)。

與無感染常溫組和低溫組相比，H9N2病毒感染后，H9N2感染常溫組和低溫組體重均顯著降低。感染后2～10 d中，H9N2感染低溫組小鼠體重明顯低于H9N2感染常溫組。與無感染常溫組小鼠相比，無感染低溫組小鼠精神狀態(tài)在低溫處理后的前2天明顯下降，但體重?zé)o顯著變化(圖2)。

感染后第2天后，2個(gè)病毒感染組小鼠均表現(xiàn)出明顯的精神沉郁，被毛失去光澤，其中H9N2病毒感染低溫組臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，多見小鼠消瘦、發(fā)抖、蜷縮和扎堆。感染后第7天，H9N2感染常溫組小鼠體重及精神狀態(tài)開始逐漸恢復(fù)，而H9N2感染低溫組小鼠臨床癥狀仍嚴(yán)重，直到感染后第10天，H9N2感染低溫組小鼠體重及精神狀態(tài)開始恢復(fù)。感染后第14天，各組小鼠體重及精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常。

圖1 H9N2病毒感染后不同溫度處理的小鼠生存曲線Fig.1 Survival curve of mice in different temperature after H9N2 virus infection

*表示H9N2感染低溫組與H9N2感染常溫組差異顯著(P<0.05),**表示H9N2感染低溫組與H9N2感染常溫組差異極顯著(P<0.01)。 * indicates the significant difference between H9N2+Cold treatment group and H9N2+Room temperature group. * indicates significant difference(P<0.05), ** indicates extremely significant difference between them (P<0.01).圖2 H9N2病毒感染不同溫度處理的小鼠體重變化Fig.2 Changes of mice body weight in different temperature after H9N2 virus infection

2.2 不同溫度處理的小鼠肺臟病變及肺水腫程度

無感染低溫組與常溫組相比，小鼠肺臟無明顯眼觀病理變化。H9N2感染低溫組與H9N2感染常溫組相比，肺大體病變更為嚴(yán)重。尤其D7(感染后第7天)時(shí)，H9N2感染常溫組小鼠肺臟表面僅有極少數(shù)淤血點(diǎn)和非常小面積的實(shí)變區(qū)域；而H9N2感染低溫組的小鼠肺臟邊緣鈍圓、充血淤血嚴(yán)重，肺臟出現(xiàn)大面積的實(shí)變區(qū)域(圖3)。

肺系數(shù)是反映肺水腫程度的重要指標(biāo)。如圖4所示，感染第5天后，H9N2感染常溫組和H9N2感染低溫組小鼠肺系數(shù)遠(yuǎn)高于無感染的常溫及低溫組。而且H9N2感染低溫組的肺系數(shù)較H9N2感染常溫組顯著升高(P<0.05)，在第7天極顯著升高(P<0.01)。第14天時(shí)，H9N2感染常溫組與H9N2感染低溫組小鼠肺系數(shù)都降低，但仍高于無感染常溫組，且H9N2感染低溫組小鼠肺系數(shù)仍顯著高于H9N2感染常溫組(P<0.05)。

圖3 H9N2病毒感染后不同溫度處理的小鼠肺臟眼觀大體病變Fig.3 Gross pulmonary lesions of mice in different temperature after H9N2 virus infection

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)，ns表示無顯著性差異。 * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01), “ns” indicates no significant difference.圖4 H9N2感染后不同溫度處理的小鼠肺系數(shù)Fig.4 Lung index of mice in different temperature after H9N2 virus infection

2.3 不同溫度處理的小鼠肺組織病理學(xué)變化

在感染后第5天，無感染低溫組小鼠肺泡壁輕微增寬，肺泡結(jié)構(gòu)清晰(圖5(b))。H9N2感染常溫組小鼠肺泡正常結(jié)構(gòu)喪失，毛細(xì)血管淤血，肺泡中大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，殘留少量擴(kuò)張的肺泡(圖5(c))；H9N2感染低溫組小鼠肺泡正常結(jié)構(gòu)完全喪失，肺部肺間質(zhì)嚴(yán)重增寬，整個(gè)視野中充滿滲出液，增寬的間質(zhì)中大量的炎性細(xì)胞浸潤，少量擴(kuò)張的肺泡有殘余(圖5(d))。感染后第2 天的組織學(xué)結(jié)果與第5 天的結(jié)果趨勢一致。

(a)無感染常溫組；(b)無感染低溫組；(c)H9N2感染常溫組；(d)H9N2感染低溫組 (a) PBS+Room temperature； (b) PBS+Cold treatment； (c) H9N2+Room temperature； (d) H9N2+Cold treatment圖5 H9N2感染后第5天不同溫度處理的小鼠肺臟病理切片(200×)Fig.5 Pathological changes of lungs from mice in different temperature on the fifth day after H9N2 virus infection

2.4 ELISA法測定不同溫度處理的小鼠肺臟組織勻漿中TNF-α和IL-1β的含量

肺部細(xì)胞因子的水平一定程度上代表先天性免疫反應(yīng)的水平。在感染后第2天和第5天，與無感染常溫組相比，無感染低溫組小鼠肺部 TNF-α 水平顯著升高(P<0.05)，H9N2感染常溫組與H9N2感染低溫組TNF-α濃度極顯著升高(P<0.01)。而H9N2病毒感染的小鼠中，低溫組與常溫組小鼠肺部TNF-α水平無顯著差異(P>0.05)(圖6)。

與無感染常溫組相比，無感染低溫組小鼠在感染后第5天，肺部IL-1β水平顯著增高(P<0.05)，而感染后第2天未表現(xiàn)出顯著差異。H9N2感染低溫組與常溫組小鼠肺部IL-1β水平均極顯著高于無感染常溫組(P<0.01)，極顯著高于無感染低溫組(P<0.01)。而接受H9N2感染的小鼠中，低溫組與常溫組在所檢測的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(感染后第2天和第5天)，肺組織中IL-1β水平均無顯著差異(P>0.05)(圖6)。

2.5 不同溫度處理的小鼠肺組織病毒載量的動(dòng)態(tài)變化

病毒噬斑測定結(jié)果顯示在H9N2病毒感染后第2天H9N2感染常溫組和H9N2感染低溫組小鼠肺組織病毒載量無顯著差異，在感染后第5天H9N2感染低溫組小鼠肺組織病毒載量顯著高于H9N2感染常溫組(P<0.01)。

圖6 H9N2感染后不同溫度處理的小鼠肺部細(xì)胞因子的變化Fig.6 Changes of cytokines in the lungs of mice in different temperature after H9N2 virus infection

圖7 H9N2感染后不同溫度處理的小鼠肺部病毒載量Fig.7 Viral titers in the lungs of mice in different temperature after H9N2 virus infection

3 討 論

研究表明，某些H9N2亞型流感病毒毒株可以誘導(dǎo)小鼠感染發(fā)病及呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)生[16-17]。在本試驗(yàn)中，通過鼻腔接種106EID50劑量的禽流感A/Chicken/Hebei/4/ 2008(H9N2)病毒，成功誘導(dǎo)BALB/c系小鼠呼吸窘迫綜合征的發(fā)生，小鼠表現(xiàn)出體重下降、精神沉郁、被毛雜亂、呼吸困難等呼吸窘迫綜合征的典型臨床癥狀。病毒感染后5～7 d，小鼠臨床癥狀明顯，肺組織病變嚴(yán)重。病毒感染后第14 天，小鼠臨床癥狀恢復(fù)，肺組織無明顯病變。因此使用該毒株可以有效建立小鼠感染H9N2亞型流感病毒模型并模擬小鼠感染H9N2亞型流感病毒后從出現(xiàn)臨床癥狀到恢復(fù)痊愈的過程。

關(guān)于低溫和呼吸道病毒感染之間的關(guān)系，國際社會(huì)百年來一直爭議不斷。許多研究已經(jīng)表明低溫會(huì)加重呼吸道感染。Danielides等[18]對醫(yī)療記錄進(jìn)行了回顧性研究，結(jié)果表明，低溫與急性喉炎的發(fā)生率增加有關(guān)。也有研究表明，低溫會(huì)增加小鼠流感病毒感染的死亡率[19]。但一些觀點(diǎn)認(rèn)為，寒冷并不會(huì)增加病毒感染的幾率[20]。有研究表明，使受試者在-12～15 ℃寒冷房間中暴露2～4 h[21]或者在32 ℃ 水浴中浸泡數(shù)小時(shí)[8]，并未使人體對呼吸道病毒的易感性增加。本研究發(fā)現(xiàn)，與H9N2感染常溫組小鼠相比，環(huán)境低溫處理的H9N2病毒感染小鼠臨床癥狀更為嚴(yán)重，病毒感染后5～7 d，H9N2感染常溫組小鼠體重下降約5%，而H9N2感染低溫組小鼠體重下降約20%。環(huán)境低溫處理還致使H9N2病毒感染的小鼠存活率由95%降為67%，存活率大幅降低。肺臟組織學(xué)結(jié)果顯示，環(huán)境低溫處理的H9N2病毒感染小鼠肺臟病變程度更嚴(yán)重。這些結(jié)果均表明低溫會(huì)加重H9N2病毒對小鼠的致病性。

本研究發(fā)現(xiàn)，與無感染常溫組相比，無感染低溫組小鼠肺泡壁增厚，肺組織中TNF-α和IL-1β顯著增加。這可能是由于低溫處理引起小鼠機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，損害了健康組織[22]。同時(shí)，應(yīng)激反應(yīng)會(huì)增加促炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)一步損傷健康組織[23]。接受H9N2病毒感染的常溫小鼠與低溫小鼠肺組織中細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β無顯著差異，提示可能是這兩種細(xì)胞因子并沒有在低溫加重的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮較大的作用，可能存在其他細(xì)胞因子導(dǎo)致低溫組小鼠炎癥反應(yīng)加重。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，需要更廣泛地鑒定可能在其中起作用的細(xì)胞因子。

感染后第5天，H9N2病毒感染低溫組相比于H9N2病毒感染常溫組病毒載量顯著增加，提示低溫條件下病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制能力增強(qiáng)。低溫可能通過影響病毒和宿主，共同促進(jìn)病毒復(fù)制能力的增強(qiáng)，進(jìn)而加重流感發(fā)病程度。低溫條件可促進(jìn)脂質(zhì)在病毒膜上的排列，有助于流感病毒顆粒的穩(wěn)定性[10]；還可增加流感病毒在流感傳播模型豚鼠中的傳播性[9]。黏膜纖毛清除機(jī)制是消除呼吸道上皮表面吸入的病原體和刺激物的關(guān)鍵機(jī)制。面對氣道的黏膜層會(huì)捕獲微粒和微生物，將含微生物體和顆粒的粘液向小鼠的鼻子外側(cè)移動(dòng)和移向人類的喉部，吞咽或吐出粘液捕獲的微粒和微生物。低溫使宿主呼吸道中粘蛋白分泌增多、黏膜纖毛擺動(dòng)頻率增加，使黏膜纖毛清除機(jī)制受損[4]；低溫還使宿主的抗病毒先天免疫減弱，F(xiàn)oxman等[13]發(fā)現(xiàn)支持鼻病毒復(fù)制的小鼠氣道上皮細(xì)胞在鼻腔較冷溫度下，RIG-I受體依賴性的干擾素分泌較少，抗病毒防御應(yīng)答降低，使病毒在鼻腔更有效的復(fù)制。同時(shí)，低溫導(dǎo)致的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)損傷健康的肺組織，進(jìn)而使病毒在肺部更有效的復(fù)制。具體到該試驗(yàn)當(dāng)中，環(huán)境低溫加重H9N2病毒感染對小鼠致病性的原理還有待進(jìn)一步的研究。

在甲型流感導(dǎo)致的急性肺損傷模型中，很少有關(guān)于低溫作為刺激因素的研究。本研究發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)加重H9N2亞型流感病毒感染小鼠的嚴(yán)重程度，對進(jìn)一步揭示流感與環(huán)境的關(guān)系具有參考價(jià)值，將有助于采取科學(xué)有效的措施預(yù)防和治療甲型流感感染，進(jìn)而大大改善健康狀況和生活質(zhì)量。