勿都巴拉 吳江鴻 麗 春 胡斯樂(lè) 高樹新

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

內(nèi)蒙古絨山羊是經(jīng)過(guò)常年人工選育形成的地方品種，其毛被潔白并有光澤，粗毛和絨纖維混合生長(zhǎng)，多數(shù)絨山羊毛比絨長(zhǎng)，是我國(guó)特有優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源[1]。環(huán)境和絨山羊自身因素均影響著羊絨的生長(zhǎng)與脫落。除以上因素的影響外山羊絨的生長(zhǎng)主要受到光周期的影響，日照由長(zhǎng)變短時(shí)即夏至左右開始啟動(dòng)毛囊發(fā)育分子，使毛囊發(fā)育并絨毛開始生長(zhǎng)[2]。絨山羊毛囊發(fā)育和絨毛生長(zhǎng)需要多個(gè)基因和信號(hào)通路參與，其中Notch是重要信號(hào)通路之一。多項(xiàng)研究表明毛囊發(fā)育與Notch信號(hào)通路的參與密切相關(guān)，其可調(diào)節(jié)毛囊細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程[3-4]。

JAG1(Jagged1)基因是Notch信號(hào)通路配體之一，可與 Notch 受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合而活化Notch信號(hào)通路，激活靶基因，參與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[5-6]。另外，JAG1是β-catenin/Lef/Tcf復(fù)合物的靶基因，β-Catenin誘導(dǎo)JAG1的轉(zhuǎn)錄而激活Notch信號(hào)通路[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體及配體在人[8-9]和小鼠[10-11]表皮中表達(dá)，JAG1在小鼠毛囊的休止期表達(dá)，到毛囊生長(zhǎng)期表達(dá)增強(qiáng)[7]。小鼠皮膚中JAG1基因缺失會(huì)阻斷Notch信號(hào)通路，從而抑制毛囊生長(zhǎng)周期，并導(dǎo)致毛囊轉(zhuǎn)變?yōu)槟夷[細(xì)胞；如果JAG1過(guò)表達(dá)，表皮中Notch的激活會(huì)引起毛囊基部擴(kuò)張、皮脂腺增大和毛囊異常聚集[7,12]。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠毛囊休止期有高度活性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在皮膚中積累，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)Notch配體JAG1的表達(dá)，通過(guò)JAG1表達(dá)來(lái)促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的活性，從而毛囊逐漸進(jìn)入生長(zhǎng)期。此外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中缺失JAG1會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵的表皮分化基因Bgn、Ccnd1、Gdf10、Sox4、Sox7和Timp3的表達(dá)顯著降低[13]。近年來(lái)，JAG1的研究除了毛囊發(fā)育以外，與腫瘤發(fā)生相關(guān)報(bào)道也常見(jiàn)。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌細(xì)胞中JAG1高表達(dá)，敲除JAG1可以抑制GATA1(JAG1轉(zhuǎn)錄因子)誘導(dǎo)的Notch激活和細(xì)胞增殖，從而顯著抑制卵巢癌發(fā)展。小鼠JAG1通過(guò)抑制腫瘤抑制因子LKAB1表達(dá)而導(dǎo)致胰腺腫瘤，而JAG1的缺失促進(jìn)從惡性腫瘤到良性囊性病變，因此，JAG1是腫瘤促進(jìn)因子[15]。綜上，關(guān)于JAG1研究主要集中在人和小鼠毛囊發(fā)育、腫瘤發(fā)生和發(fā)展等方面，JAG1是否能在絨山羊毛囊中表達(dá)，是否與絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，是否可作為絨毛生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控基因還有待研究。

因此，本研究利用生物信息學(xué)方法分析絨山羊JAG1蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征；通過(guò)免疫組化和qRT-PCR檢測(cè)內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊不同時(shí)期JAG1的表達(dá)部位和表達(dá)水平，為深入研究絨山羊JAG1對(duì)毛囊發(fā)育調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

從內(nèi)蒙古阿拉善種羊場(chǎng)選擇體格相等、無(wú)疾病、2周歲內(nèi)蒙古絨山羊阿拉善型母羊3只，采集毛囊退行期(1月)、休止期(4月)、生長(zhǎng)前期(7月)和生長(zhǎng)期(9月)皮膚樣品。

1.1.2皮膚樣品的采集

在絨山羊體側(cè)中線肩胛骨后緣5 cm處用消過(guò)毒的刀片采取2～4.0 cm2大小皮膚樣品2塊，1塊裝入標(biāo)有耳號(hào)的凍存管后立即投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?塊放入現(xiàn)用現(xiàn)配的4%多聚甲醛溶液中固定24 h，之后分別以75%、80%和90%乙醇依次脫水之后無(wú)水乙醇中保存。

1.1.3主要試劑和儀器

60 ℃進(jìn)口石蠟(Leica，德國(guó))，4%多聚甲醛(現(xiàn)用現(xiàn)配)、蘇木素、伊紅和飽和碳酸鋰(Sigma，美國(guó))，鼠源Anti-JAG1-Antibody(一抗)(Santa，美國(guó))，UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒(鼠/兔)(二抗)、DAB顯色試劑盒(邁新，中國(guó))，Trizol試劑盒、M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen，美國(guó))，Power SYBER?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems，美國(guó))，dNTP Mixture(TAKARA，大連)，RQ1 RNase-Free Dnase、Recombinant RNasin?RNase Inhibitor(Promega，美國(guó))等。

石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))，真空抽泵(TAISITE，天津)，烘片機(jī)(惠友，浙江),顯微鏡(Nikon，日本)，成像系統(tǒng)(Nikon，日本)，QuantStudio TM 7 Flex Real time PCR system(Applied Biosystems，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)CBC/UVP I-D001(CapitalBio，北京)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1絨山羊JAG1生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取絨山羊、綿羊、牛、馬、豬、駱駝、羊駝和人等物種的JAG1蛋白氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

通過(guò)ExPASy在線軟件中的ProtParam和ProtScale軟件分別分析絨山羊JAG1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和親疏水性；使用SignalP 5.0 Server和TMHMM Server V 2.0在線工具預(yù)測(cè)絨山羊JAG1蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)；借助運(yùn)用NetPhos 3.1 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server軟件預(yù)測(cè)JAG1蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)；利用SOPMA程序預(yù)測(cè)JAG1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2內(nèi)蒙古絨山羊JAG1蛋白表達(dá)定位檢測(cè)

內(nèi)蒙古絨山羊皮膚樣品組織切片置于切片架上放入烘片機(jī)內(nèi)65 ℃烘干30～40 min；二甲苯脫蠟15 min之后回水；滴加3% H2O2，室溫靜置15 min后1×PBS洗3次；加一滴藍(lán)色的山羊非免疫血清，室溫靜置15 min后1×PBS洗3次；滴加鼠源Anti-JAG1-Antibody置于4 ℃冰箱過(guò)夜(至少16 h)；吸取一抗后切片用1×PBS洗3次，滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(二抗)(黃色液體)室溫靜置10～15 min 后1×PBS洗3次；滴加鏈霉素康生物素蛋白-過(guò)氧化酶(橙色液體)室溫靜置10～15 min后1×PBS洗3次；利用現(xiàn)配現(xiàn)用的DAB顯色液顯色，邊顯色邊在顯微鏡觀察，在蒸餾水中終止顯色；濃度遞增梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片，鏡檢。

1.2.3皮膚總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按照 Trizol試劑盒方法提取絨山羊1月、4月、7月和9月皮膚的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和OD值， 將符合要求的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書合成cDNA后將其保存到-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4內(nèi)蒙古絨山羊JAG1基因皮膚不同時(shí)期表達(dá)分析

根據(jù)Genebank中絨山羊JAG1基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因，其引物根據(jù)Genebank中絨山羊β-actinmRNA(登錄號(hào)：NM_001314342.1)序列設(shè)計(jì)(表1)，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器檢測(cè)JAG1基因在內(nèi)蒙古絨山羊不同月份皮膚中的表達(dá)?？偡磻?yīng)體系為20 μL：2×Power SYBER?Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，退火和延伸60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，然后以0.5 ℃/10 s的速率從60 ℃ 緩慢升溫至95 ℃。每個(gè)時(shí)期的樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

表1 熒光定量PCR引物序列信息Table 1 Information of fluorescence quantitative PCR primer sequence and product length

1.2.5數(shù)據(jù)分析

獲得熒光定量PCR檢測(cè)Ct值數(shù)據(jù)后利用2-ΔΔCt法計(jì)算毛囊發(fā)育4個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)JAG1基因在絨山羊不同毛囊生長(zhǎng)期的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 絨山羊JAG1氨基酸相似性分析

利用MEGA7.0軟件對(duì)絨山羊、綿羊、牛、馬、豬、羊駝、駱駝和人等物種的JAG1氨基酸序列相似性分析，并構(gòu)建了物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示，絨山羊與綿羊JAG1親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到99.5%，與牛、馬、豬、羊駝、駱駝和人的相似性分別為98.4%、95.7%、95.5%、95.5%、95.4%和95.3%，表明JAG1在哺乳動(dòng)物進(jìn)化中比較保守。

圖1 JAG1氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 JAG1 amino acid phylogenetic tree

2.2 絨山羊JAG1蛋白基本理化性質(zhì)分析

絨山羊JAG1基因編碼1 218個(gè)氨基酸，通過(guò)ExPASy在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，JAG1蛋白質(zhì)的分子式是C5591H8630N1672O1835S146，相對(duì)分子量為133 310.89 ku，等電點(diǎn)為5.67，脂肪系數(shù)為50.76，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為46.35，屬于不穩(wěn)定蛋白。JAG1蛋白包含20種氨基酸，其中出現(xiàn)頻率較高的是Cys(10.8%)，Gly(9.2%)，Ser(7.7%)。帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)為114個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)為141個(gè)，因此JAG1蛋白整體帶負(fù)電。親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白質(zhì)疏水性最大值為3.211，位于第20個(gè)氨基酸位點(diǎn)，親水性最小值為-3.056，位于第1 199～1 200位個(gè)氨基酸(圖2)，總平均親水性為-0.585，為親水性蛋白。

圖2 絨山羊JAG1蛋白親疏水性分析Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic analysis of cashmere goat JAG1 protein

2.3 絨山羊JAG1蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

絨山羊JAG1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3(a) 所示，JAG1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)值為0.992 8，大于閾值0.5，表明該蛋白有信號(hào)肽的分泌蛋白，信號(hào)肽位于第1～29個(gè)氨基酸序列。剪切位點(diǎn)在第30和31位氨基酸之間，幾率為0.463 3?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(圖3(b))。運(yùn)用NetPhos 3.1 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server軟件預(yù)測(cè)JAG1蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，絨山羊JAG1蛋白具有61個(gè)絲氨酸、26個(gè)蘇氨酸、19個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖3 (c))，有63個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，第143、217、745、960、991和1 110氨基酸殘基處有N-糖基化位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白中α-螺旋占12.64%，β-轉(zhuǎn)角占4.68%，延伸連占14.29%，無(wú)規(guī)則卷曲占68.39%(圖3(d))。

(a)信號(hào)肽預(yù)測(cè)；(b)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；(c)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；(d)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) (a) Signal peptide prediction; (b) Transmembrane structure prediction; (c) Phosphorylation site prediction; (d) Secondary structure prediction 圖3 絨山羊JAG1蛋白結(jié)構(gòu)特征分析Fig.3 Structural characteristic analysis of Cashmere goat JAG1 protein

2.4 內(nèi)蒙古絨山羊JAG1蛋白在毛囊中的表達(dá)定位

采集內(nèi)蒙古絨山羊毛囊4個(gè)不同生長(zhǎng)期皮膚樣品進(jìn)行免疫組化研究。結(jié)果表明，毛囊退行期和休止期毛囊中未檢測(cè)到JAG1蛋白表達(dá)(圖4 (a)和(b))；生長(zhǎng)前期和生長(zhǎng)期在毛囊毛乳頭細(xì)胞中檢測(cè)到JAG1蛋白陽(yáng)性信號(hào)(圖4 (c)和(d)中箭頭指示)。

(a)退行期；(b)休止期；(c) 生長(zhǎng)前期；(d)生長(zhǎng)期 (a) Catagen; (b) Telogen; (c) Early stage of anagen; (d) Anagen 圖4 內(nèi)蒙古絨山羊JAG1蛋白的毛囊表達(dá)定位分析Fig.4 Localization of JAG1 protein expression in hair follicle of Inner Mongolia Cashmere goat

2.5 內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊不同生長(zhǎng)期JAG1 mRNA的表達(dá)

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)JAG1mRNA在內(nèi)蒙古絨山羊不同毛囊時(shí)期的皮膚中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，JAG1mRNA在毛囊4個(gè)時(shí)期的皮膚中均有表達(dá)，退行期、休止期和生長(zhǎng)前期的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，但毛囊生長(zhǎng)期在皮膚中的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量(P<0.05)(圖5)。

3 討 論

絨山羊羊絨的生長(zhǎng)受光周期和多種刺激抑制信號(hào)的調(diào)控，并呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性。絨山羊的毛囊生長(zhǎng)包括生長(zhǎng)期，退行期和休止期[16]。生長(zhǎng)期的特征是毛囊角化細(xì)胞的快速增殖和毛干的伸長(zhǎng)和增厚。退行期毛球上皮細(xì)胞群開始凋亡，毛囊長(zhǎng)度收縮，縮回到皮膚表面。休止期毛囊毛乳頭進(jìn)入休眠，上皮細(xì)胞變成一個(gè)小“指頭”[17]。毛囊中含有獨(dú)特的毛囊上皮和間充質(zhì)成分，其相互作用引起毛囊周期性變化[18-19]。

不同字母代表差異顯著(P<0.05)，相同的字母代表差異不顯著(P>0.05)。 Different letters in the column represent significant differences (P<0.05) while same letters represent no significant differences(P>0.05)。圖5 內(nèi)蒙古絨山羊JAG1 mRNA在不同毛囊生長(zhǎng)期的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of JAG1 mRNA in different hair follicle growth period of Inner Mongolia cashmere goats

本研究以絨山羊JAG1為研究目標(biāo)，首先對(duì)JAG1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，絨山羊與其他7個(gè)物種的JAG1氨基酸序列相似性均90%以上，表明JAG1在進(jìn)化過(guò)程中比較保守，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較相近。這意味著該基因在絨山羊、綿羊、牛、馬、豬、駱駝、羊駝和人等哺乳動(dòng)物皮膚毛囊中的作用具有同源性。對(duì)JAG1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，絨山羊JAG1蛋白的半衰期為30 h，卻不是穩(wěn)定性蛋白，出現(xiàn)這種不一致的特性可能與其特殊的作用方式或Notch其他配體有關(guān)，需進(jìn)一步研究和探討。絨山羊JAG1信號(hào)肽位于第1～29個(gè)氨基酸序列，并且預(yù)測(cè)值達(dá)到0.992 8(大于閾值0.5)，表明JAG1是分泌到胞外的蛋白質(zhì)。在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)JAG1蛋白有一個(gè)剪切位點(diǎn)和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)有多個(gè)磷酸化和糖基化位點(diǎn)，Gupta等[20]研究表明，磷酸化和糖基化是蛋白質(zhì)一種修飾方式，磷酸化是細(xì)胞內(nèi)對(duì)蛋白功能進(jìn)行調(diào)控的普遍機(jī)制，糖基化是細(xì)胞產(chǎn)生不同功能蛋白質(zhì)的一種形式。因此，本研究推測(cè)這些磷酸化和糖基化位點(diǎn)可能是調(diào)控絨山羊JAG1蛋白功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。

通過(guò)免疫組化和qPCR技術(shù)檢測(cè)了JAG1在內(nèi)蒙古絨山羊皮膚中表達(dá)部位和相對(duì)表達(dá)量。免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在退行期和休止期毛囊中未檢測(cè)到JAG1蛋白的表達(dá)，毛囊生長(zhǎng)前期和生長(zhǎng)期在毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)。這一結(jié)果與Ambler等[21]對(duì)小鼠皮膚JAG1基因表達(dá)調(diào)控研究一致，利用原位雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠毛囊生長(zhǎng)期JAG1mRNA在毛球基質(zhì)層(鄰近奧伯線)細(xì)胞里表達(dá)。JAG1的表達(dá)會(huì)激活Notch信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞的分化，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[7]。qPCR結(jié)果表明，JAG1mRNA在退行期、休止期和生長(zhǎng)前期皮膚中均有表達(dá)，但差異不顯著(P>0.05)，到生長(zhǎng)期JAG1mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，與Estrach等[7]的小鼠JAG1基因表達(dá)研究結(jié)果一致。從免疫組化和qPCR結(jié)果看出，JAG1蛋白在內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)期表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)新毛囊生長(zhǎng)。JAG1基因缺失可導(dǎo)致毛囊轉(zhuǎn)化為毛囊間表皮分化細(xì)胞的囊腫；相反，會(huì)引發(fā)毛囊基部擴(kuò)張、皮脂腺增大[7]。JAG1基因促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)可能與Notch信號(hào)通路、β-catenin有關(guān)，毛囊中有活性的β-catenin/Lef1誘導(dǎo)JAG1表達(dá)，進(jìn)而激活真皮乳頭細(xì)胞中的Notch位點(diǎn)，促進(jìn)毛囊細(xì)胞分化[7]。也可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān)，皮膚中常駐的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)高水平的JAG1，而JAG1的表達(dá)促進(jìn)毛囊干細(xì)胞分化和毛囊再生[13]。因此，JAG1參與人、小鼠和山羊等哺乳動(dòng)物的毛囊形態(tài)構(gòu)建，誘導(dǎo)毛囊形成毛母質(zhì)、根鞘、毛干等結(jié)構(gòu)，是調(diào)控內(nèi)蒙古絨山羊毛囊周期性生長(zhǎng)的候選基因之一。

4 結(jié) 論

絨山羊JAG1氨基酸序列在物種進(jìn)化過(guò)程中比較保守， JAG1在內(nèi)蒙古絨山羊毛囊退行期和休止期表達(dá)較低，且隨著毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期其在毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)，并表達(dá)量逐漸增加。綜上，絨山羊JAG1在毛囊發(fā)育和周期性生長(zhǎng)中具有調(diào)控作用，對(duì)進(jìn)一步研究JAG1調(diào)控絨山羊絨毛生長(zhǎng)相關(guān)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。