劉 爽 魏大為 李 芬 王興平 羅仍卓么 蔡小艷 馬 云

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021)

隨著人們生活水平的不斷提高，高品質(zhì)牛肉是人們消費的主導(dǎo)方向，其供不應(yīng)求。在我國，牛肉的供應(yīng)以黃牛為主，但是我國黃牛的肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量低，與國外優(yōu)秀的品種相比，仍有很大差距。如何提高黃牛的肉品質(zhì)，提高市場占有量，是我國畜牧業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。

肌內(nèi)脂肪是一種高遺傳力性狀[1]，通過提高磷脂含量影響風(fēng)味、提高保水能力影響多汁性、降低剪切力影響嫩度，決定了牛肉的品級和價格。肌內(nèi)脂肪沉積是一個復(fù)雜的生物過程，每一步均受基因的精準調(diào)控，據(jù)統(tǒng)計有900多個基因調(diào)控肌內(nèi)脂肪含量[2]。miRNA對肌內(nèi)脂肪沉積起重要調(diào)控作用，研究其調(diào)控機制，有利于揭示產(chǎn)肉性狀的分子機制，為肉牛遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

miRNA是物種進化的主要動力之一，miR-2439-5p在2009年首次被發(fā)現(xiàn)，并命名為牛特異性miRNA，但其功能未知[3]。先前的研究表明，內(nèi)含子miRNA通常與它們的宿主基因一起轉(zhuǎn)錄，并且可以對其宿主基因發(fā)揮協(xié)同和拮抗的調(diào)節(jié)作用[4]。miR-2439-5p位于牛MRTFA(Myocardin related transcription factor A，心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A)基因的內(nèi)含子區(qū)域，研究表明，MRTFA是決定祖細胞向脂肪細胞生成的關(guān)鍵因素之一，MRTFA基因的缺失增加了脂肪生成[5-6]。但miR-2439-5p是否反饋調(diào)節(jié)其宿主基因MRTFA，從而調(diào)控牛脂肪細胞分化的功能和作用機制尚不明確。

1 材料與方法

1.1 查詢miR-2439-5p在?；蚪M上的位置

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的牛參考基因組序列(ARS-UCD1.2或bosTau9)和注釋信息，查找miR-2439-5p在?；蚪M上的位置。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

使用Reciprocal BLAST定位前體序列bta-mir-2439到牛、人、小鼠、大鼠、狗、豬、馬、綿羊、山羊和雞等動物基因組；使用miRbase BLAST(http:∥www.mirbase.org/search.shtml)并對前體序列bta-mir-2439和加工成熟序列miR-2439-5p進行物種間保守性分析；確定在其他物種中沒有檢測到miR-2439-5p的直向同源物的成熟miRNA。

使用NCBI數(shù)據(jù)庫獲得前體序列bta-mir-2439和宿主基因MRTFA的上游序列(2kb)，并使用GPMiner軟件(http:∥gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)和EMBOSS Cpgplot軟件(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)進行CpG島分析，然后使用Promoter 2.0(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和Neural Network Promoter Prediction(http:∥fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html)啟動子區(qū)域分析軟件來預(yù)測啟動子區(qū)域，最后PROMO軟件(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)預(yù)測啟動子區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和miRWalk數(shù)據(jù)庫(http:∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預(yù)測miR-2439-5p的靶基因，并用DAVID軟件(https:∥david.ncifcrf.gov/)對靶基因進行GO分析和KEGG分析。

1.3 miR-2439-5p的組織表達譜分析

采集3頭28月齡的郟縣紅牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、背脂組織；采集3頭28月齡和牛的心、肝、脾、肺、背脂組織；采集3頭28月齡固原黃牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、背脂和腎周脂組織，快速用手術(shù)剪分離成黃豆大小放入凍存管投入到液氮罐中，帶回實驗室凍存于-80 ℃冰箱，備用。

根據(jù)RT-PCR頸環(huán)引物設(shè)計原理，并結(jié)合miRbase數(shù)據(jù)庫上miR-2439-5p序列，設(shè)計其特異莖環(huán)引物及熒光定量引物，并以U6作為內(nèi)參基因。引物合引物設(shè)計詳見表1，引物由安徽通用生物有限公司合成。

表1 本研究用到的引物信息Table 1 Information of primers in the study

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用2-ΔΔCt法對試驗數(shù)據(jù)進行分析， SPSS 22.0軟件對miR-2439-5p表達量進行單因素方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-2439-5p在?；蚪M的位置分析

由圖1所示，miR-2439-5p位于牛5號染色體的反義鏈，牛MRTFA基因第三內(nèi)含子，范圍111 845 903至111 845 924，屬內(nèi)含子miRNA，宿主基因是MRTFA。前體序列bta-mir-2439的5’端臂和3’端臂均能加工產(chǎn)生2個成熟miRNA，分別為miR-2439-5p和miR-2439-3p。

將圖書館總分館制建設(shè)督查評估納入本地區(qū)公共文化服務(wù)考核指標。區(qū)文化部門負責(zé)對本區(qū)下轄街鎮(zhèn)分館和居村等各類服務(wù)點建設(shè)及運行情況進行評估考核。以落實意識形態(tài)工作責(zé)任制為要求，納入街鎮(zhèn)文化管理工作考核。并逐步引入第三方開展公眾滿意度測評，完善社會評價體系。認真對照服務(wù)標準，針對本地本單位實際，找缺補差，提能提效。

2.2 miR-2439-5p的物種間保守性分析

使用Reciprocal BLAST檢測牛、人、小鼠、大鼠、狗、豬、馬、綿羊、山羊、和雞等動物基因組是否存在前體序列bta-mir-2439直系同源物，僅在?；蚪M定位到bta-mir-2439序列。使用miRbase Blast搜索各物種bta-mir-2439相似序列，在其他物種未發(fā)現(xiàn)其高度相似序列，表明bta-mir-2439是牛特異性microRNA前體分子之一(表2)。同樣，miR-2439-5p不存在與其他物種miRNA高度相似序列，miR-2439-5p是牛特異性miRNA(表3)。

圖1 miR-2439-5p在牛基因組位置示意圖Fig.1 Mapping of miR-2439-5p in bovine genome

表2 bta-mir-2439與各物種前體miRNA的比對Table 2 Alignment of bta-mir-2439 to precursor miRNAs of various species

表3 miR-2439-5p與各物種成熟miRNA的比對Table 3 Alignment of miR-2439-5p to mature miRNAs of various species

2.3 miR-2439-5p上游序列CpG島分析

如圖2(a)所示，bta-mir-2439上游序列(2 kb)不存在CpG島，提示其啟動子不是典型的GC-rich啟動子或是可能主要依靠宿主基因MRTFA轉(zhuǎn)錄生成。

如圖2(b)所示，GPMiner軟件分析顯示，牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的CpG島位于上游序列705～2 000 bp；EMBOSS Cpgplot軟件分析顯示，其CpG島位于上游序列1 693～1 942 bp。GPMiner軟件預(yù)測的CpG島位置與人MRTFA基因啟動子多處序列同源(表4)，進一步證實牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的CpG島位置存在啟動子區(qū)域。

2.4 miR-2439-5p的啟動子預(yù)測

軟件Promoter 2.0預(yù)測結(jié)果(表5)：bta-mir-2439上游序列(2 kb)存在3個轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcriptional start site, TSS)，900 bp處預(yù)測得分最高，為0.739。軟件Neural Network Promoter Prediction預(yù)測結(jié)果(表6)：同樣預(yù)測得到3個啟動子，上游區(qū)域89～139預(yù)測的啟動子得分最高，為0.97。綜合結(jié)果，bta-mir-2439上游序列1 273 bp處是TSS，啟動子范圍為773～1 223 bp。

軟件Promoter 2.0預(yù)測結(jié)果(表7)：牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的600 bp處存在轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)，預(yù)測得分為0.505，預(yù)測結(jié)果可信度低(Marginal prediction)。軟件Neural Network Promoter Prediction預(yù)測結(jié)果(表8)：預(yù)測得到1 545～1 595 bp、1 702～1 752 bp和1 710～1 760 bp 啟動子區(qū)域。綜合CpG島預(yù)測結(jié)果，牛MRTFA基因上游序列1 751 bp處是TSS，啟動子區(qū)域范圍為1 251～1 801 bp。

(a)bta-mir-2439上游序列CpG島分析；(b)牛MRTFA基因上游序列CpG島分析 (a) CpG island analysis of upstream sequence of bta-mir-2439; (b) CpG island analysis of upstream sequence of bovine MRTFA gene圖2 CpG島分析圖譜Fig.2 CpG island analysis map

表4 牛MRTFA基因啟動子序列與Ensembl已知人MRTFA基因 啟動子序列(-2 000～第一外顯子端)比對分析Table 4 Alignment analysis of bovine MRTFA gene promoter sequences to Ensembl known human MRTFA gene promoter sequences (-2 000-first exon end)

表5 bta-mir-2439的Promoter預(yù)測Table 5 Promoter predictions of the bta-mir-2439 by Promoter 2.0

2.5 miR-2439-5p的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

使用軟件PROMO預(yù)測miR-2439-5p啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，設(shè)置參數(shù)差異(Dissimilar)小于0。結(jié)果顯示，miR-2439-5p啟動子共有8個C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、2個RARα轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和1個AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等。

牛MRTFA基因啟動子共有6個C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和1個RARα轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等。

表6 bta-mir-2439 NNPP預(yù)測Table 6 Promoter predictions of the bta-mir-2439 using NNPP

表7 牛MRTFA Promoter預(yù)測Table 7 Promoter predictions of bovine MRTFA by Promoter 2.0

2.6 miR-2439-5p的靶基因預(yù)測、GO分析和KEGG分析

TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫共預(yù)測出3 232個靶基因；miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫共預(yù)測出1 185個靶基因；2個數(shù)據(jù)庫預(yù)測交集靶基因共621個(圖3(a))。通過對交集靶基因進行GO富集分析(圖4)可知的靶基因顯著富集在激素分泌負調(diào)節(jié)、長鏈脂肪酸生物合成和胰島素應(yīng)答等多個生物學(xué)過程，作用的位置主要在受體復(fù)合物和細胞質(zhì)囊泡中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔助因子活性和核心啟動子結(jié)合的分子作用。其中生物學(xué)過程中的激素分泌負調(diào)節(jié)、長鏈脂肪酸生物合成和胰島素應(yīng)答條目下的基因可能會對脂肪細胞分化和代謝產(chǎn)生影響。

表8 牛MRTFA NNPP預(yù)測Table 8 Promoter predictions of bovine MRTFA by NNPP

為了探究miR-2439-5p的生物學(xué)功能，本研究在GO分析的基礎(chǔ)上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)對交集靶基因進行了KEGG富集分析。結(jié)果顯示，靶基因顯著富集的信號通路中，mTOR信號通路、MAPK信號通路、AMPK信號通路、TGF-β信號通路、胰島素抵抗信號通路、Hippo信號通路、脂肪細胞分泌因子信號通路和不飽和脂肪酸生物合成信號通路調(diào)控牛脂肪細胞分化和代謝(圖3(b))。

2.7 miR-2439-5p的組織表達譜分析

miRbase數(shù)據(jù)庫顯示，miR-2439-5p和miR-2439-3p深度測序表達豐度分別為7 reads(4 experiments)和44 reads(3 experiments)。二者表達豐富度均偏低，依據(jù)目前對miRNA和miRNA*的定義[7]，miRNA和miRNA*同時產(chǎn)生，miR-2439-3p測序豐度較高，屬于miRNA；miR-2439-5p測序豐度較低，屬于miRNA*。miRNA*易被降解、在體內(nèi)遠小于miRNA的積累水平，但有其特殊使命。

由圖5(a)所示，測序結(jié)果表明，miR-2439-5p在郟縣紅牛心、脾、肺、腎、肌肉和背脂組織均有表達，而在肝臟組織中不表達。其在腎組織中相對高表達，與肌肉和背脂組織存在顯著性差異(P<0.01)。

由圖5(b)和圖5(c)所示，使用TAKARA公司熒光定量PCR試劑盒檢測miR-2439-5p在和牛、固原黃牛各組織中的表達差異，結(jié)果顯示：miR-2439-5p在和牛各組織廣泛表達，在心、肺和背脂高表達，在背脂中表達量最高，與肝和脾的表達量有顯著性差異(P<0.05)；miR-2439-5p同樣在固原黃牛各組織廣泛表達，但各組織表達量無顯著性差異(P>0.05)。

(a)miR-2439-5p靶基因預(yù)測；(b)miR-2439-5p靶基因KEGG分析 (a) miR-2439-5p target genes prediction; (b) KEGG analysis of miR-2439-5p target genes圖3 miRNA-2439-5p下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of downstream regulatory networks of miRNA-2439-5p

3 討 論

從進化的角度看，大多數(shù)miRNA在不同動物之間高度保守，但仍存在少數(shù)動物物種特異性miRNA。本研究通過對miR-2439-5p進行物種間保守性分析，發(fā)現(xiàn)miR-2439-5p是牛特異性miRNA。miRNA以其快速的進化動力學(xué)而聞名，調(diào)控動物體內(nèi)30%基因的表達，miR-2439-5p的出現(xiàn)可能會影響數(shù)百種基因的表達，加速了牛的進化過程。

哺乳動物約有50%的miRNA屬于內(nèi)含子miRNA(Intergenic miRNA)[8]，本研究確定miR-2439-5p在牛基因組上的位置，發(fā)現(xiàn)miR-2439-5p是內(nèi)含子miRNA，宿主基因是MRTFA。研究表明，MRTFA是決定祖細胞向脂肪細胞生成的關(guān)鍵因素之一，MRTFA基因的缺失增加了脂肪生成[5-6]。內(nèi)含子miRNA通常協(xié)同/拮抗宿主基因發(fā)揮生物學(xué)功能[9]，因此推斷，miR-2439-5p可能反饋調(diào)控宿主基因MRTFA，抑制或促進牛脂肪細胞分化。

內(nèi)含子miRNA一般隨宿主基因共同轉(zhuǎn)錄，共享相同的啟動子和調(diào)節(jié)元件[10]。CpG島主要位于基因的外顯子區(qū)域和啟動子(Promoter)區(qū)域，是鑒別啟動子區(qū)域的重要條件之一。本研究發(fā)現(xiàn)，牛MRTFA基因啟動子區(qū)域存在CpG島，并與已知人MRTFA基因啟動子存在同源性。因此，miR-2439-5p可能同宿主基因MRTFA共享啟動子元件。miR-2439-5p的上游序列不存在明顯CpG島區(qū)域，表明牛MRTFA基因可能更容易被轉(zhuǎn)錄激活。但也有研究者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子miRNA也有自己獨立的啟動子，不依靠宿主基因獨自轉(zhuǎn)錄[11]。鑒于miR-2439-5p上游含有豐富的堿基序列，極有可能擁有獨立的啟動子區(qū)域，提示miR-2439-5p的啟動子不是典型的GC-rich啟動子。使用NNPP軟件和Promoter2.0進一步提高啟動子預(yù)測結(jié)果準確性，結(jié)合文獻報告核心啟動子區(qū)域在TSS上游500 bp、下游50 bp[12]，本研究預(yù)測牛MTRFA基因上游1 751 bp處為TSS，啟動子區(qū)域為上游1 251～1 801 bp。miR-2439-5p上游1 273 bp處是TSS，啟動子范圍為773～1 323 bp。

篩選和鑒定miRNA及其靶基因是研究miRNA功能機制的關(guān)鍵一步。借助生物信息學(xué)方法可以對miRNA靶基因鑒定提供理論指導(dǎo)，對研究miRNA的功能機制有著重要指向作用。本研究使用TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫和miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫篩選得到了miR-2439-5p的621個靶基因，顯著富集的信號通路中，mTOR信號通路、MAPK信號通路和AMPK信號通路能夠促進脂肪合成、脂肪細胞分化及影響脂肪細胞穩(wěn)定[13-15]；TGF-β信號通路和Hippo信號通路能夠抑制成熟脂肪細胞的生成[16-17]；胰島素抵抗信號通路、脂肪細胞分泌因子信號通路和不飽和脂肪酸生物合成信號通路參與脂肪細胞的代謝和應(yīng)答[18-19]。

(a)GO富集分析-生物學(xué)過程;(b)GO富集分析-分子功能;(c)GO富集分析細胞組分 (a) GO-Analysis-BP(Biological process); (b) GO-Analysis-MF(Molecular function); (c) GO-Analysis-CC(Cellular component)圖4 miRNA-2439-5p靶基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of miRNA-2439-5p target genes

圖5 miR-2439-5p在郟縣紅牛(a)、和牛(b)和固原黃牛(c)各組織表達譜Fig.5 Expression difference of miR-2439-5p in different tissues in Jiaxian Red cattle (a), Wagyu (b) and Guyuan cattle (c)

此外，分析miRNA在不同組織的相對表達量有助于進一步探究其生物學(xué)功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-2439-5p在和牛的背脂中表達量最高，與肝和脾的表達量有顯著性差異(P<0.05)，表明miR-2439-5p可能調(diào)控牛脂肪沉積。

4 結(jié) 論

miR-2439-5p是牛特異性miRNA、內(nèi)含子miRNA和miRNA*(相對低表達miRNA)。miR-2439-5p上游可能受C/EBPβ和RARα等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，既可能同宿主基因MRTFA共享啟動子元件，也可能擁有獨立的啟動子區(qū)域。miR-2439-5p下游可能通過mTOR信號通路、MAPK信號通路、AMPK信號通路、TGF-β信號通路、胰島素抵抗信號通路、Hippo信號通路、脂肪細胞分泌因子信號通路和不飽和脂肪酸生物合成信號通路等，反饋調(diào)節(jié)其宿主基因MRTFA，從而調(diào)控牛脂肪細胞分化與代謝。miR-2439-5p在郟縣紅牛、和牛和固原黃牛的心、脾、肺、背脂組織均有表達，但在體內(nèi)積累水平較低，其特殊的生物學(xué)功能有待進一步研究。