江石平，朱婉萍

(浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007)

低共熔溶劑是一種新型溶劑，它是由某些固體有機(jī)分子與特定的離子型化合物按照一定比例混合，在室溫下呈液體狀態(tài)的低共熔混合物[1]，具有低熔點(diǎn)、低成本、低毒性、易制備、能再生、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)[2]?，F(xiàn)代研究表明，低共熔溶劑能顯著提高多酚、黃酮、多糖等成分的提取率[3-4]，是提取中藥活性成分的理想溶劑。

南方紅豆杉Taxuschinensisvar.mairei是國(guó)內(nèi)特有的紅豆杉科紅豆杉屬植物[5]，其葉中成分主要為紫杉萜、黃酮、多糖、生物堿、揮發(fā)油等[6]，其中黃酮具有抗癌、抗肝臟毒性、抗菌、抗氧化等多種藥理作用[7]。目前，中藥中黃酮類成分的提取溶劑主要是水和有機(jī)溶劑[8]，但均存在能耗高、制備周期長(zhǎng)、提取率低、不夠環(huán)保等缺點(diǎn)，故尋找綠色溶劑具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取技術(shù)，研究不同低共熔溶劑對(duì)總黃酮提取率的影響，并利用響應(yīng)面對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該成分開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

紫外-可見光分光光度計(jì)(型號(hào)UV-1800,日本島津公司)；電子分析天平(型號(hào)Sartorius BS224S，德國(guó)賽多利斯公司)；超聲清洗器(型號(hào)KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司)；磁力攪拌器(型號(hào)90-2，常州越新儀器制造有限公司)。

氯化膽堿[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號(hào)B1920039]；1,4-丁二醇(批號(hào)B1807141)、丙三醇(批號(hào)170315)、1,3-丁二醇(批號(hào)D1726006)、乙二醇(批號(hào)20170425)(西隴科學(xué)股份有限公司)；硝酸鋁(美國(guó)Mackin公司，批號(hào)C10373927)；亞硝酸鈉(批號(hào)20140107)、氫氧化鈉(批號(hào)20121114)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080-201409)。紅豆杉葉購(gòu)于寧波泰康紅豆杉生物科技有限公司，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院藥用資源研究中心浦錦寶研究員鑒定為南方紅豆杉Taxuschinensisvar.mairei枝葉。超純水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 低共熔溶劑制備 按照1∶1∶1摩爾比精密稱取氯化膽堿-(1,4-丁二醇)-水、氯化膽堿-丙三醇-水、氯化膽堿-乙二醇-水、氯化膽堿-(1,3-丁二醇)-水適量，置于燒杯中，在85 ℃下磁力攪拌器充分?jǐn)嚢柚廉a(chǎn)生均勻剔透的液體為止，冷卻至室溫，即得。

2.2 線性關(guān)系考察 參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道，精密稱取蘆丁對(duì)照品5 mg，置于25 mL量瓶中，65%乙醇定容至刻度，超聲溶解，配制0.2 mg/mL母液，分別精密吸取5、4、3、2、1、0 mL至10 mL量瓶中，65%乙醇定容至5 mL，搖勻，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，65%乙醇定容，搖勻，放置15 min。采用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定蘆丁在200～800 nm波長(zhǎng)處的吸光度，發(fā)現(xiàn)該成分在508 nm處有最大吸收。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得到方程為A=11.958X+0.019(R2=0.999 3)，在0.019～0.096 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 供試品溶液制備 取紅豆杉葉末約0.1 g，精密稱定，加入一定體積不同體積分?jǐn)?shù)(0、12.5%、25%、75%、100%)的低共熔溶劑水溶液，在一定溫度下超聲提取一段時(shí)間，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密量取0.2 mL，置于10 mL量瓶中，65%乙醇定容5 mL，搖勻，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，再以65%乙醇定容，搖勻，放置15 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，公式為提取率=[(C×V/0.2×N)/M]×100%，其中C為總黃酮質(zhì)量濃度，V為樣品溶液體積，N為稀釋倍數(shù)(10倍)，M為樣品質(zhì)量。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 低共熔溶劑種類 考察氯化膽堿-(1,4-丁二醇)-水、氯化膽堿-丙三醇-水、氯化膽堿-乙二醇-水、氯化膽堿-(1,3-丁二醇)-水對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。由此可知，4種低共熔溶劑的提取率均高于65%乙醇提取，以氯化膽堿-乙二醇-水更明顯，故選擇其作為提取溶劑。

注：DES-1為氯化膽堿-乙二醇-水，DES-2為氯化膽堿-丙三醇-水，DES-3為氯化膽堿-(1,4-丁二醇)-水，DES-4為氯化膽堿-(1,3-丁二醇)-水。圖1 低共熔溶劑種類對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4.2 低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù) 考察0、12.5%、25%、75%、100%對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，在75%時(shí)總黃酮提取率最高，故選擇其作為低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)。

圖2 低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4.3 液料比 考察10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，總黃酮提取率隨著液料比增加先顯著升高，后略有降低，在30∶1時(shí)最高，故選擇其作為液料比。

圖3 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4.4 提取時(shí)間 考察30、40、50、60、70 min對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，提取60 min時(shí)提取率最高，故選擇其作為提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4.5 提取溫度 考察30、40、50、60、70 ℃對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。由此可知，提取率隨著提取溫度增加先升后降，在60 ℃時(shí)最高，故選擇其作為提取溫度。

圖5 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)總黃酮提取率影響較大的低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)作為影響因素，總黃酮提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)(Y)，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，共17組，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得方程為Y=65.45-1.80A-1.26B+0.96C+0.35AB-0.79AC-0.64BC-8.01A2-1.83B2-3.83C2，方差分析見表3。由此可知，模型P<0.01，具有顯著性差異；失擬項(xiàng)P>0.05，表明模型失擬度不顯著，結(jié)果準(zhǔn)確可靠；相關(guān)系數(shù)R2為0.980 8，表明可用該方程解釋98.08%的數(shù)據(jù)；因素A、B、C、A2、B2、C2對(duì)總黃酮提取率均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)，影響程度依次為A>B>C。

表3 方差分析

響應(yīng)面分析[9]見圖6。由此可知，隨著液料比、低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)增加，總黃酮提取率先升后降，低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)的變化曲面比液料比陡峭，等高線沿前者方向的變化相對(duì)密集，表明它對(duì)響應(yīng)值峰值的影響更大；低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)的變化曲面比提取時(shí)間陡峭，表明前者對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大于后者；液料比、提取時(shí)間的變化曲面坡度相差不大，兩者交互作用不明顯。

圖6 各因素響應(yīng)面圖

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件，得到最優(yōu)工藝為低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)72.13%，液料比27.22∶1，提取時(shí)間51.37 min，總黃酮提取率為6.711%，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)方便操作，將其修正為低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)72%，液料比27∶1，提取時(shí)間51 min。在此優(yōu)化工藝下進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均提取率為6.703%，與預(yù)測(cè)值6.711%接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

文獻(xiàn)[10]報(bào)道，提取紅豆杉總黃酮最佳提取溶劑為65%乙醇；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與65%乙醇提取比較，4種低共熔溶劑的提取率分別高出23.17%、16.34%、19.07%、17.76%，表明低共熔溶劑可顯著提高總黃酮提取率，其原因可能是它對(duì)植物細(xì)胞壁有較強(qiáng)的破壞作用[11]，并且具有一定黏度，有利于紅豆杉葉粉末懸浮分散在溶劑中，增大接觸面積，從而更有利于黃酮流出。結(jié)果表明，低共熔溶劑種類不同，提取率升高程度有所差異，以丙二醇最明顯，推測(cè)可能是其本身溶解性、黏性、導(dǎo)電性等物理性質(zhì)的差異所致。

另外，低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率也有顯著影響，其較高時(shí)溶液比較黏稠，不利于進(jìn)入紅豆杉葉基質(zhì)內(nèi)部，導(dǎo)致提取率下降；當(dāng)加入一定量水后，可顯著降低黏度，使其更好地滲入到基質(zhì)內(nèi)部，破壞細(xì)胞壁，促進(jìn)黃酮流出，但含水量過高時(shí)會(huì)破壞醇羥基與氯化膽堿之間的氫鍵，減少低共熔溶劑與黃酮之間的相互作用[12]，導(dǎo)致提取率下降。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅豆杉葉總黃酮工藝，發(fā)現(xiàn)該方法優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取工藝，可為該成分開發(fā)利用提供參考。