蘭 嵐，袁佳佳，周 恒，苗 水，李雯婷，季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

二硫代氨基甲酸酯(鹽)類農(nóng)藥(Dithiocarbamates，DTCs)是一系列具有廣譜抗菌作用的殺菌劑，優(yōu)良的抑菌性[1-2]和耐藥性[3]使其在各種作物的種植中應(yīng)用廣泛，近年來(lái)該類農(nóng)藥的使用范圍擴(kuò)大至根莖類等中藥材[4-6]，且使用量不斷呈上升趨勢(shì)。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2019規(guī)定了人參、三七塊根和須根中DTCs的最大殘留限量[7]，對(duì)中藥材中DTCs殘留量的測(cè)定提出了更高的要求。

由于DTCs化學(xué)性質(zhì)特殊，難以直接測(cè)定[8]，目前國(guó)內(nèi)外法規(guī)多通過(guò)GC法或GC-MS法測(cè)定酸解反應(yīng)生成的二硫化碳(CS2)達(dá)到測(cè)定DTCs殘留總量的目的[9-11]。CS2法主要有2個(gè)缺陷，首先該方法只能測(cè)定殘留總量，難以區(qū)分DTCs的亞類；其次易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。據(jù)報(bào)道，含有植物源CS2，如異硫氰酸苯酯和色胺硫代氨基甲酸酯的十字花科植物，或有腐敗傾向的基質(zhì)在酸解作用下生成CS2，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性[12-13]。中藥材基質(zhì)復(fù)雜，化學(xué)成分豐富，與該領(lǐng)域研究較多的食品基質(zhì)相比較，中藥材中DTCs的測(cè)定難度更大。為解決上述問題，亟需開發(fā)原理不同的檢驗(yàn)方法，以期與CS2法互補(bǔ)，更好地為中藥材中DTCs的殘留研究服務(wù)。

本研究以代森錳鋅為典型代表的乙撐二硫代氨基甲酸酯(鹽)類殺菌劑(EBDs)和以丙森鋅為典型代表的甲基乙撐二硫代氨基甲酸酯(鹽)類殺菌劑(PBDs)為檢測(cè)對(duì)象，選取典型根莖類中藥材三七、人參、黨參和黃芪，在特定pH的水溶液中將代森錳鋅和丙森鋅分別轉(zhuǎn)化為水溶性的鈉鹽，繼而采用碘甲烷為衍生化試劑將代森鈉和丙森鈉轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的甲基化產(chǎn)物，經(jīng)分散固相萃取凈化后氮吹濃縮，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。研究采用甲基衍生化結(jié)合QuEChERS樣品前處理，以碘甲烷-乙腈溶液作為甲基化產(chǎn)物的提取溶劑和衍生反應(yīng)媒介，簡(jiǎn)化了操作程序，實(shí)現(xiàn)了中藥材中代森錳鋅和丙森鋅的快速、專屬測(cè)定，有利于掌握更多的農(nóng)藥施用和殘留信息。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1290超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；API 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司，配置AB SCIEX數(shù)據(jù)處理軟件、ESI+電噴霧源)；Sartorius MSU225P-ICE-DU、Sartorius CP224S型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；震蕩儀(美國(guó)FLUK公司)；渦旋儀(德國(guó)IKA公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)OI-SYS公司)；Centrifuge 5810 R型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Agilent Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3.0 mm，2.7 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.2 試劑與藥物 甲酸、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、鹽酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、氫氧化鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽(一水)和四丁基硫酸氫銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、硅膠、C18和石墨化碳黑(天津博納艾杰爾科技有限公司)；碘甲烷[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度>99.5%]；代森錳鋅(批號(hào)80328，78.4%)、丙森鋅(批號(hào)978990，85.0%)和同位素內(nèi)標(biāo)氘代莠去津(德國(guó)Dr.Ehrensterfer GmbH公司)。

1.3 材料 為保證方法的通用性，前處理?xiàng)l件優(yōu)化中，考察了凈化填料對(duì)三七、金銀花等不同藥用部位的凈化效果。由于多年生根莖類中藥材常定期施用代森錳鋅、丙森鋅以防治根部腐爛，實(shí)驗(yàn)主要對(duì)三七、人參、黨參和黃芪進(jìn)行了方法學(xué)考察。所有藥材均為國(guó)家抽驗(yàn)性評(píng)價(jià)樣品，均由上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥/天然藥物保健食品室楊新華老師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2.00 min，60%～25% A；2.00～6.00 min，25% A；6.10～8.00 min，5% A；8.10～11.00 min，60% A)；體積流量0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；內(nèi)標(biāo)法定量；代森錳鋅甲基化產(chǎn)物定量離子m/z134，定性離子m/z117、193；丙森鋅甲基化產(chǎn)物定量離子m/z206.9，定性離子m/z131.2；氘代莠去津定量離子m/z178.8，定性離子m/z101.1。三七代森錳鋅、丙森鋅加樣樣品的MRM圖見圖1。

1.代森錳鋅 2.丙森鋅1.mancozeb 2.propineb圖1 三七中代森錳鋅和丙森鋅加樣樣品的MRM圖Fig.1 MRM image for mancozeb and propineb in spiked Notoginseng Radix

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力50.0 psi(1 psi=6.895 kPa)；輔助氣壓力50.0 psi；氣簾氣壓力20.0 psi；碰撞氣壓力7.0 psi；離子源溫度450 ℃；掃描時(shí)間50 s；碰撞室入口電壓10 V；碰撞室出口電壓12 V。

2.3 化學(xué)衍生試劑制備

2.3.1 氫氧化鈉溶液(10 mol/L)取氫氧化鈉40 g，加水使溶解成100 ml，即得。

2.3.2 EDTA-Na2堿性提取液 取L-半胱氨酸鹽酸鹽2.5 g、EDTA-Na246.73 g和氫氧化鈉9 g，加水500 mL使溶解，以10 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，即得。本液應(yīng)在涼處避光保存。

2.3.2.1 四丁基硫酸氫銨溶液 稱取13.6 g四丁基硫酸氫銨，加水定容至100 mL。

2.3.2.2 碘甲烷-乙腈溶液 取碘甲烷1 mL，加乙腈300 mL，混合均勻，即得。

2.4 對(duì)照品溶液制備

2.4.1 對(duì)照品貯備液 準(zhǔn)確稱取適量代森錳鋅、丙森鋅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成100 mg/L的對(duì)照品貯備溶液，用前振搖3 min使混懸均勻。本液應(yīng)在-20 ℃避光保存。

2.4.2 內(nèi)標(biāo)溶液 準(zhǔn)確稱取適量氘代莠去津，用乙腈逐級(jí)稀釋成6 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.5 樣品前處理

2.5.1 提取 取中藥材樣品，粉碎成粉末(過(guò)3號(hào)篩)，取約3 g(準(zhǔn)確至0.01 g)，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入堿性EDTA-Na2提取溶液10 mL，渦旋使樣品充分浸潤(rùn)，置振蕩器上劇烈震蕩20 min，4 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL聚苯乙烯具塞離心管；殘?jiān)儆脡A性EDTA-Na2提取溶液重復(fù)處理2次，每次5 mL，合并堿性提取液。以6 mol/L鹽酸調(diào)pH值至8.0，加入四丁基硫酸氫銨溶液1 mL，混合均勻。精密加入0.1 mol/L碘甲烷-乙腈15 mL，再精密加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，置振蕩器上劇烈震蕩20 min(500次/min)，放置10 min后，加入無(wú)水硫酸鎂與氯化鈉的混合粉末(2∶1)6 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩3 min(500次/min)，于冰浴中冷卻3 min，4 000 r/min離心5 min。

2.5.2 凈化與濃縮 精密移取上清液9 mL，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管(無(wú)水硫酸鎂900 mg、PSA300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、石墨化炭黑90 mg、硅膠300 mg)中，渦旋使充分混勻，再置振蕩器上劇烈震蕩5 min(500次/min)使凈化完全，4 000 r/min離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上吹至約0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.6 基質(zhì)混合對(duì)照品使用液 分別移取一定體積的代森錳鋅、丙森鋅對(duì)照品貯備液稀釋得到1、10 mg/L的混合對(duì)照品溶液，將適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)中，按 “2.5”項(xiàng)下方法制備，得到5、10、50、100、200、400、1 000 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。以2種農(nóng)藥的對(duì)照品使用液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，各物質(zhì)的定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 線性關(guān)系考察 按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，代森錳鋅、丙森鋅分別在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好(r>0.99)。以線性最低點(diǎn)作為定量限樣品溶液，定量定性峰均可被檢測(cè)到且信噪比均大于10，折算2種農(nóng)藥的定量限均為0.005 mg/kg。結(jié)果見表1。

表1 各樣品線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various samples

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取避光保存的1 000 μg/L的三七基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，結(jié)果顯示樣品溶液中丙森鋅甲基化衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性較差，最好于衍生反應(yīng)后的12 h內(nèi)完成進(jìn)樣。

2.7.3 加樣回收率試驗(yàn) 以空白中藥材樣品中添加回收實(shí)驗(yàn)確定代森錳鋅、丙森鋅的加樣回收率，4個(gè)加樣水平分別為0.005、0.01、0.05、0.10 mg/kg，每個(gè)加樣水平均平行測(cè)定7次，代森錳鋅的加樣回收率在78.3%-99.6%，丙森鋅的加樣回收率在75.2%～100.4%，精密度以加樣回收率RSD表示，代森錳鋅加樣精密度為2.1%～9.5%，丙森鋅加樣精密度為2.3%～9.3%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求，方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=7)Tab.2 Results of recovery tests for various constituents(n=7)

2.7.4 基質(zhì)效應(yīng) 將適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)中，除不稱取中藥材樣品外，其余按 “2.5”項(xiàng)下方法制備，得到代森錳鋅、丙森鋅的溶劑混合對(duì)照品溶液，與4種中藥材的基質(zhì)匹配混合對(duì)照品溶液一同進(jìn)樣檢測(cè)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示凈化效果較好，三七、人參、黨參和黃芪的抑制率均控制在3.2%～9.7%。

由于不同中藥材基質(zhì)對(duì)衍生反應(yīng)的影響程度不同，定量時(shí)采用了空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以減少基質(zhì)效應(yīng)和甲基化反應(yīng)的影響。

3 討論

3.1 甲基化試劑和反應(yīng)溶劑考察 DTCs測(cè)定中常用的甲基化衍生試劑有硫酸二甲酯[14-16]和碘甲烷[17-19]。碘甲烷可與常見的有機(jī)溶劑混溶，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，毒性較硫酸二甲酯毒性小，且過(guò)量的碘甲烷可通過(guò)氮吹除去，不需要額外的淬滅操作，因此選用碘甲烷作為衍生化試劑。常用的反應(yīng)溶劑為三氯甲烷-正己烷(3∶1)，抽濾、溶劑替換等操作步驟多，時(shí)間、人力成本高，有機(jī)試劑消耗大，難以保證檢驗(yàn)效率并帶來(lái)環(huán)境污染等問題。本研究與國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)接軌，采用QuEChERS前處理方法，使用碘甲烷-乙腈作為甲基化產(chǎn)物的提取溶劑和衍生反應(yīng)的媒介，簡(jiǎn)化了操作程序。

3.2 凈化填料配比考察 在三七、金銀花空白樣品中添加1 mg/kg的代森錳鋅和丙森鋅，按供試品溶液的制備方法提取、反應(yīng)，保持單一變量的因素考察不同凈化填料對(duì)三七、金銀花的凈化效果，結(jié)果表明適當(dāng)?shù)膬艋侄慰梢栽鰪?qiáng)待測(cè)化合物的響應(yīng)。無(wú)水硫酸鎂的用量為900 mg，旨在進(jìn)一步除去有機(jī)相中的水，保證其他凈化填料的吸附效果。C18為通用的凈化填料，對(duì)2個(gè)待測(cè)產(chǎn)物的響應(yīng)影響不大，確定用量為300 mg。在此基礎(chǔ)上考察了PSA用量為0、300、600 mg對(duì)三七、金銀花的陽(yáng)性樣品的凈化效果，結(jié)果表明三七、金銀花基質(zhì)中PSA用量對(duì)代森錳鋅衍物的響應(yīng)整體影響不大，但隨著用量的增加，丙森鋅衍生物的響應(yīng)迅速降低，表明PSA用量不宜過(guò)大。鑒于石墨化碳PC在吸附色素方面的優(yōu)勢(shì)，凈化調(diào)料中使用量為90 mg。三七在硅膠用量為300 mg時(shí)代森錳鋅、丙森鋅衍生物響應(yīng)最高?；谝陨峡疾旖Y(jié)果，最終凈化填料使用配比為無(wú)水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、PC 90 mg、硅膠300 mg。

近年來(lái)農(nóng)藥殘留研究熱點(diǎn)主要圍繞在儀器的高精尖、檢測(cè)參數(shù)的高通量等方面，而常常忽視一些化學(xué)性質(zhì)特殊的農(nóng)藥。作為根莖類、葉類藥用植物使用頻率最高的殺菌劑之一，自DTCs被發(fā)明和使用以來(lái)，其殘留研究雖然起步較早，但較集中于食品領(lǐng)域，中藥材中該類農(nóng)藥的檢測(cè)仍缺乏深入研究，目前研究數(shù)據(jù)證實(shí)CS2法存在假陽(yáng)性的可能，而甲基化衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性欠佳，且在某些中藥材基質(zhì)中存在干擾，凸顯了特殊農(nóng)藥個(gè)性化研究的重要性。

4 結(jié)論

本研究采用堿性提取液，將代森錳鋅、丙森鋅轉(zhuǎn)化為水溶性鈉鹽，在合適的衍生化條件下，采用碘甲烷-乙腈溶液，同時(shí)實(shí)現(xiàn)甲基化反應(yīng)和QuEchERS前處理，進(jìn)而建立了三七、人參、黨參和黃芪中代森錳鋅、丙森鋅QuEChERS/UPLC-MS/MS的檢測(cè)方法。該方法靈敏度高，可與CS2法互為補(bǔ)充，精準(zhǔn)測(cè)定中藥材中二硫代氨基甲酸酯(鹽)類殺菌劑亞類的殘留。