蔡萌強，劉素彤，劉君穎，張麗慧，趙文霞

1 河南中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，鄭州 450000； 2 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科，鄭州 450000

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease，AILD)是一類由異常自身免疫反應(yīng)介導的肝組織炎癥反應(yīng)，導致肝細胞和/或膽管上皮細胞損傷的慢性肝膽系統(tǒng)炎性疾病。根據(jù)生化學、組織病理學及免疫學特征，可分成以肝細胞損傷為主的自身免疫性肝炎(AIH)和以膽管上皮細胞損傷為主的原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)及原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)；同時具備上述兩種組織學特征的則稱為重疊綜合征[1]。盡管目前對環(huán)境因素和遺傳易感性在觸發(fā)免疫性肝損傷中的認識逐年增加，但AILD的確切發(fā)病機制仍未闡明[2]。AILD常伴有肝細胞和/或膽管上皮細胞的免疫炎癥損傷和慢性損傷修復(fù)反應(yīng)，易進展為肝硬化，肝衰竭，甚至肝細胞癌，因此早期診斷、及時干預(yù)是改善AILD預(yù)后的關(guān)鍵。

microRNA (miRNA)是一種內(nèi)源性、短鏈非編碼RNA分子，通過與轉(zhuǎn)錄后mRNA互補區(qū)域結(jié)合，誘導mRNA降解或抑制基因轉(zhuǎn)化后翻譯，調(diào)控靶基因表達。單一miRNA可調(diào)節(jié)數(shù)百個蛋白質(zhì)編碼基因，對細胞生物學過程(包括代謝、免疫、增殖和凋亡、發(fā)育和分化)起重要的調(diào)控作用[3]。miRNA作為生物標志物、潛在治療工具或靶點，在肝臟疾病中已進行了廣泛的研究[4]。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)miRNA異常與AILD發(fā)病過程中的免疫炎癥反應(yīng)、肝纖維化密切相關(guān)，miRNA可通過影響肝臟免疫細胞分化、膽管上皮細胞分泌及肝星狀細胞激活等，參與ALID發(fā)生發(fā)展過程。

1 miRNA與AIH

AIH是由于自身免疫異常攻擊肝細胞，導致肝細胞炎癥損傷、肝纖維化，甚至肝衰竭。以血清轉(zhuǎn)氨酶和IgG增高、自身抗體陽性為血清學特征，以肝組織出現(xiàn)中重度界面性肝炎為組織學特征[5]。然而目前AIH發(fā)病機制尚不清楚，發(fā)病機制可能與遺傳易感性、細胞分子機制及免疫調(diào)節(jié)功能缺失相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，AIH患者的miRNA譜發(fā)生明顯改變，提示miRNA可能參與AIH的發(fā)生發(fā)展過程。

1.1 miRNA參與肝臟免疫炎癥反應(yīng) CD4+T淋巴細胞是一種重要的免疫細胞，在AIH中，免疫介導的肝損傷是由自身反應(yīng)性CD4+T淋巴細胞引起的[7]。有學者[8]認為，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞 (Treg) /輔助性T淋巴細胞 (Th) 17及其相關(guān)細胞因子分泌失衡可能是AIH的一個重要發(fā)病機制。miR-155是一種在淋巴細胞內(nèi)高表達的miRNA，可通過調(diào)控Treg和Th17分化，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[9-10]。Xia等[11]發(fā)現(xiàn)在刀豆蛋白A (ConA)誘導的AIH小鼠模型中，肝組織miR-155明顯升高，并在48 h時達正常對照組的9.2倍。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155表達，可顯著阻止AIH小鼠肝臟Th17和Treg分化，而且由Th17分泌的促炎因子(IL-17A、IL-23)也明顯降低，但由Treg分泌的抗炎因子(IL-10)未受到影響。不僅如此，抑制miR-155表達后，由ConA誘導的血清ALT、AST、ALP升高亦被顯著抑制。Blaya等[12]發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，AIH患者肝組織miR-155表達顯著增高(較正常對照增加7.6±5.6倍)；而外周血單核細胞miR-155表達卻降低，且經(jīng)過免疫抑制治療后，外周血單核細胞中的miR-155水平仍無顯著改變；進一步將敲除miR-155基因小鼠和野生型小鼠同時注射ConA后，與野生型小鼠相比，miR-155缺陷小鼠肝組織炎癥壞死更顯著，血清ALT、AST以及受體相互作用蛋白激酶(RIPK1、RIPK3)等凋亡相關(guān)因子水平顯著增高。因此，miR-155在免疫介導的肝損傷中可能具有多效性作用，在肝組織和炎癥細胞中的正確表達可能均重要。

外泌體是一種脂質(zhì)雙層膜小泡，可由多種細胞分泌，直接將供體細胞中的mRNA、miRNA及蛋白質(zhì)等生物活性分子轉(zhuǎn)移至受體細胞，以調(diào)控受體細胞反應(yīng)[12]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC)的外泌體可減輕由肝臟特異性抗原S100、內(nèi)毒素(LPS)誘導的AIH模型小鼠的肝損傷，其機制與抑制淋巴細胞浸潤及血清TNFα、IL-17A和IL-1β水平相關(guān)；當應(yīng)用轉(zhuǎn)染miR-223前體的BMSC外泌體時，其對AIH小鼠肝損傷的保護作用更顯著；而轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑時，外泌體的保護效果完全消失。研究結(jié)果表明miR-223對S100和LPS誘導AIH模型小鼠肝損傷具有顯著保護作用。新近研究[14]發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)異?；罨瘏⑴c了許多自身免疫性疾病的進展。的確，NLRP3信號通路在AIH小鼠中被顯著激活，研究發(fā)現(xiàn)含miR-223的BMSC外泌體可下調(diào)NLRP3，提示miR-223可能通過調(diào)控NLRP3信號通路防治AIH疾病進展。

1.2 miRNA參與AIH肝纖維化 目前以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合硫唑嘌呤為主的治療方案可使38%～93%的AIH患者得到緩解，但仍有30%～50%的患者治療無效從而進展為肝硬化[15]。Tu等[16]研究發(fā)現(xiàn)AIH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織內(nèi)miR-143水平明顯低于正常對照，作者通過轉(zhuǎn)染miR-143使AIH小鼠體內(nèi)miR-143過表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-143組小鼠血清和肝組織內(nèi)TNFα、核因子-κB(NF-κB)及Ⅳ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、TGFβ等促肝纖維化基因表達水平顯著低于無轉(zhuǎn)染AIH對照小鼠[17]，且肝臟形態(tài)及大小基本恢復(fù)正常；進一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶1(transforming growth factor-β3activated kinase 1,TAK1)磷酸化水平隨肝損傷程度增加而上調(diào)，經(jīng)miR-143干預(yù)的AIH小鼠肝組織TAK1磷酸化水平明顯降低，提示TAK1可能是miR-143的下游靶點。研究結(jié)果表明，miR-143可通過調(diào)節(jié)TAK1磷酸化改善由S100和LPS誘導的AIH小鼠肝組織炎癥損傷和纖維化。

1.3 miRNA作為AIH的生物標志物 miR-122是肝細胞內(nèi)表達量最高的一種miRNA，占肝臟miRNA總量的70%以上，具有高度的肝臟特異性。病理狀態(tài)下，miR-122可參與多種肝臟疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、藥物性肝炎、肝癌等)的發(fā)生發(fā)展過程[18-20]。Migita等[21]發(fā)現(xiàn)AIH患者與健康受試者相比，體內(nèi)miR-122明顯升高(可達7.34倍)，并與患者血清ALT、AST水平呈正相關(guān)，且經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療好轉(zhuǎn)后其水平明顯下調(diào)。眾所周知，miR-21可通過維持T淋巴細胞增殖與抑制其凋亡，調(diào)節(jié)細胞免疫參與多種自身免疫疾病[22]。與miR-122類似，miR-21在AIH患者血清中明顯增高，且與AIH患者血清ALT、AST相關(guān)性更顯著[21]。然而，AIH肝硬化晚期患者血清miR-122和miR-21卻明顯降低，且與肝纖維化評分呈負相關(guān)。但在組織學方面，僅miR-21表達水平與AIH炎癥的組織學分級呈正相關(guān)。因此，miR-122和miR-21有潛力成為評估AIH患者肝損傷程度和疾病狀態(tài)的生物學標志物。由于miR-122在多種肝損傷模型中均表達增高，作為診斷標志物，敏感性較高，特異性較低；而miR-21僅在AIH炎癥損傷時增高，對評估AIH炎癥損傷具有更好的特異性。

2 miRNA與PBC

PBC是一種以肝內(nèi)膽管破壞為特征的自身免疫性慢性膽汁淤積性肝病[23]，疾病主要發(fā)生于40歲以上的女性(男∶女為1∶9～10)[24]。PBC血清學特征為持續(xù)高滴度抗線粒體抗體陽性，病理生理與機體對丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2亞基(PDC-E2)免疫耐受性喪失有關(guān)，導致靶向損傷膽道上皮細胞[25-26]；組織學特征包括門靜脈淋巴細胞浸潤、選擇性破壞肝內(nèi)膽管、膽管纖維化。熊去氧膽酸(UDCA)可提高PBC患者無肝移植生存率，但仍有約40%PBC患者對熊去氧膽酸治療無應(yīng)答[23]，最終發(fā)生肝纖維化甚至肝衰竭。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個miRNA在PBC患者中呈差異性表達，呈現(xiàn)出不同的miRNA表達譜，miRNA可通過影響PBC患者膽管細胞分泌、免疫細胞凋亡、分化及炎癥損傷等方面參與PBC的病理進展過程。

2.1 miRNA調(diào)控膽汁分泌 陰離子轉(zhuǎn)換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)是膽道上皮細胞內(nèi)Cl-/HCO3-的交換器，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH和膽管碳酸氫鹽分泌，在膽管細胞頂端表面形成富含碳酸氫鹽的“保護傘”，使膽管上皮細胞免受疏水膽汁酸的影響，下調(diào)AE2表達可能引起膽汁淤積和膽管細胞損傷，導致對易感者膽管細胞免疫耐受破壞并繼發(fā)自身免疫反應(yīng)[25,27]。與正常肝組織相比，PBC患者肝組織內(nèi)miRNA-506上調(diào)3.4倍，原位雜交顯示miRNA-506主要位于肝內(nèi)膽管上皮細胞中[28]。膽管細胞內(nèi)miRNA-506通過與AE2 mRNA 3′未翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，抑制蛋白翻譯，下調(diào)AE2表達及活性，降低Cl-/HCO3-交換，導致膽道上皮細胞線粒體功能障礙、胞內(nèi)PDC-E2過表達以及對膽鹽敏感性增加，從而誘導膽管細胞凋亡、增殖。因此，抑制膽管細胞內(nèi)miRNA-506表達可使AE2活性增加，從而發(fā)揮治療作用。此外，膽管細胞中，Ⅲ型肌醇1,4,5-三磷酸受體(the type Ⅲ inositol 1,4,5- trisphosphate receptor，InsP3R3)是細胞內(nèi)Ca2+信號的主要信使分子，負責觸發(fā)基底外側(cè)Ca2+流向，InsP3R3在PBC患者膽管細胞表達下調(diào)，引發(fā)細胞內(nèi)Ca2+信號和膽汁碳酸氫鹽分泌受損，可導致膽汁淤積[29]。miR-506是表觀調(diào)控膽管細胞InsP3R3表達的主要因子，miR-506上調(diào)可直接抑制InsP3R3表達，進而抑制PBC患者膽管細胞分泌。因此，miR-506對InsP3R3表達的影響，與PBC患者的AE2下調(diào)具有協(xié)同作用，進一步降低膽管細胞的膽汁分泌，可能是miR-506調(diào)控PBC疾病進展的主要機制。也已證實，miRNA-506定位于Xq27.3，是一條X連鎖miRNA[30]，因此，從表觀遺傳學角度分析，表觀遺傳X失活和由此產(chǎn)生的miR-506上調(diào), 可能與PBC發(fā)病主要為女性密切相關(guān)。

2.2 miRNA調(diào)控膽管的免疫炎癥反應(yīng) 研究[31]發(fā)現(xiàn)，在PBC患者外周血、肝臟及淋巴結(jié)內(nèi)與PDC-E2發(fā)生反應(yīng)的CD4+T淋巴細胞數(shù)量明顯增加，提示CD4+T淋巴細胞在PBC發(fā)病機制中可能起重要作用。Nakagawa等[32]通過微陣列和qRT-PCR在研究PBC患者CD4+T淋巴細胞內(nèi)的miRNA時，發(fā)現(xiàn)有miR-181a、miR-181b、miR-374b、miR-425 4種miRNAs表達下調(diào)。N-Ras作為T淋巴細胞受體信號通路上游靶點，是PBC膽管細胞衰老相關(guān)因子，可活化T淋巴細胞參與PBC發(fā)展過程[33]，微陣列研究和靶點預(yù)測提示：miR-181a、miR-181b、miR-374b、miR-425可能參與協(xié)同調(diào)節(jié)N-Ras靶點，繼而通過T淋巴細胞受體信號通路引發(fā)肝內(nèi)炎癥因子表達增加。同時體外試驗發(fā)現(xiàn)，當miR-425過表達時，可抑制N-Ras靶點及相應(yīng)炎癥因子(IL-2、INFγ)表達。

Th17可在自身免疫和病原入侵的背景下，分泌IL-6、IL-17、IL-22、TNFα等多種細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和促炎作用[34]。Song等[35]發(fā)現(xiàn)與正常人和乙型肝炎患者相比，PBC患者外周血Th17占比顯著升高，且T淋巴細胞內(nèi)miR-181a表達下調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者體內(nèi)抗細胞凋亡蛋白(Bcl-2)表達水平顯著增高；Bcl-2蛋白表達不僅與miR-181a水平呈負相關(guān)，且與Th17占比呈正相關(guān)。研究結(jié)果表明，miR-181a的下調(diào)可通過增加Bcl-2表達，以抑制Th17凋亡，進而促進PBC疾病進程中的T淋巴細胞活化。Liang等[36]分析PBC患者血漿和外周單核細胞內(nèi)miRNA后，發(fā)現(xiàn)無論血清還是單核細胞，miR-92a表達均下調(diào)，且與PBC患者外周血Th17占比呈負相關(guān)；進一步研究發(fā)現(xiàn)外周單核細胞內(nèi)miR-92a和IL-17A可以共表達，表明miR-92a可能引發(fā)T淋巴細胞亞群失衡，特別是調(diào)節(jié)Th17增加，最終在PBC疾病進展中扮演重要角色。

3 miRNA與PSC

PSC是一種罕見的慢性進展性膽道疾病，其特征是自身免疫反應(yīng)誘導的膽管損傷、多發(fā)性膽管狹窄、膽汁淤積，繼而發(fā)生肝組織炎癥、纖維化甚至膽管惡性腫瘤。PSC病因和發(fā)病機制極其復(fù)雜，具體病理生理機制尚不清楚。與其他自身免疫性肝病不同，PSC發(fā)病人群主要為青年男性。此外，PSC與炎癥性腸病密切相關(guān)，70%的PSC患者伴發(fā)炎癥性腸病，5%～10%的炎癥性腸病患者合并PSC[37]。并且迄今為止，尚無藥物治療對臨床結(jié)局有顯著影響，肝移植仍是大多數(shù)患者的最終需要[38]。目前miRNA與PSC的研究主要集中于參與并調(diào)控PSC肝纖維化進展的研究方向。

多藥耐藥基因-2敲除小鼠(Mdr2-/-)與人類PSC臨床過程相似，因此常被用作為研究PSC的模型[39]。膽道損傷和增生性肝纖維化是PSC和Mdr2-/-模型的典型病理特征。miR-200b的表達在晚期PSC患者和Mdr2-/-的膽管細胞中均增加，體外應(yīng)用miR-200b抑制劑處理人肝星狀細胞可降低肝星狀細胞中促纖維化基因和血管生成基因(VEGF-A/C, VEGFR-2/3等)表達，減輕肝纖維化[40]。研究發(fā)現(xiàn)，以褪黑素預(yù)處理或長期暴露于黑暗環(huán)境中的Mdr2-/-膽管細胞miR-200b顯著降低，提示褪黑激素/miR-200b軸可能是包括PSC在內(nèi)的膽管損傷和纖維化的治療靶點。Hall等[41]研究發(fā)現(xiàn)miR-24/menin調(diào)節(jié)軸可能在PSC發(fā)展至肝纖維化過程中發(fā)揮作用。Menin蛋白可通過調(diào)節(jié)TGFβ1通路參與肝纖維化過程[42]，與野生對照小鼠相比，Mdr2-/-PSC模型小鼠飼養(yǎng)至12周時，肝組織menin水平降低，但在66周時明顯增加，而肝組織miR-24表達卻與menin變化完全相反。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-24表達后，肝組織menin及促纖維化因子(TGFβ1、α-SMA等)表達均明顯增加，表明miR-24可負調(diào)控menin參與膽汁淤積性肝病的纖維化過程。miR-24/menin調(diào)節(jié)軸在PSC患者疾病進展中的作用仍有待進一步研究。

4 展望

AILD的病因、發(fā)病機制仍未完全闡明，既是基礎(chǔ)研究的熱點，也是臨床診療的難點。隨著miRNA調(diào)控免疫、膽汁代謝、肝組織炎癥損傷及纖維化修復(fù)證據(jù)的增加，必將加深人們對miRNA在AILD中作用的理解，為AILD診斷、防治及預(yù)后評估提供新的標志物及潛在治療靶點。日益增加的證據(jù)顯示miRNA可能參與了AILD發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)控，但miRNA在AILD臨床診療中的價值仍有待臨床數(shù)據(jù)的積累及論證，這可能是AILD未來研究的一個方向。

作者貢獻聲明：蔡萌強負責資料收集、撰寫論文；劉素彤、劉君穎、張麗慧負責修改論文；趙文霞負責擬定研究方向、寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。