胡想金，高 耀，閭 軍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病與腫瘤生物治療科，北京 100069

恒定的自然殺傷T細(xì)胞(invariant natural killer T cell，iNKT 細(xì)胞)屬于先天性T淋巴細(xì)胞亞群，表達(dá)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)相關(guān)受體的同時(shí)也表達(dá)T淋巴細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)，是固有免疫系統(tǒng)重要組成部分。活化的iNKT細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子及細(xì)胞間信號傳遞等方式調(diào)節(jié)微環(huán)境中適應(yīng)性免疫細(xì)胞活性。iNKT細(xì)胞具有組織特異性，主要分布于機(jī)體胸腺、肝臟中，目前關(guān)于iNKT細(xì)胞的組織特異性機(jī)制尚未完全明確，但是目前越來越多證據(jù)指出iNKT細(xì)胞對肝臟免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)控作用，與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系十分密切，本文就iNKT細(xì)胞的生物學(xué)特性及其在調(diào)節(jié)肝臟免疫反應(yīng)中的重要作用，尤其就iNKT細(xì)胞在肝細(xì)胞癌(HCC)中的作用和機(jī)制做出綜述。

1 iNKT細(xì)胞生物學(xué)特性

自然殺傷T淋巴細(xì)胞(natural killer T cell，NKT 細(xì)胞)是天然的T淋巴細(xì)胞亞群，表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志物的同時(shí)也表達(dá)TCR，根據(jù)TCR特異性主要分為2個(gè)亞群：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ 型NKT細(xì)胞表達(dá)的TCR由恒定的TCRα鏈(小鼠Vα14-Jα18，人Vα24-Jα18)分別與相應(yīng)的半恒定TCRβ鏈匹配(小鼠為Vβ8.2、Vβ7或Vβ2，人類為 Vβ11)組成[1]，因此Ⅰ型NKT細(xì)胞又被命名為invariant NKT(iNKT)細(xì)胞。iNKT細(xì)胞可以特異性識別由抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)表面CD1d結(jié)合的α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)[2]，正因如此，人們通過利用α-GalCer對iNKT細(xì)胞在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增，因而目前對iNKT細(xì)胞的研究及了解較多。而Ⅱ型NKT細(xì)胞由于TCR表達(dá)多樣性和缺乏特異性，其主要被硫脂類抗原激活，并不受α-GalCer影響，是抑制抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)細(xì)胞，目前研究較少。本文主要對Ⅰ型NKT細(xì)胞，即iNKT細(xì)胞進(jìn)行討論分析。

iNKT細(xì)胞雖然是T淋巴細(xì)胞的亞群，但較傳統(tǒng)T淋巴細(xì)胞仍有諸多不同之處。首先，iNKT細(xì)胞對經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ、Ⅱ類分子遞呈的抗原無反應(yīng)，其主要識別并結(jié)合由 CD1d分子(一種非多態(tài)性MHC Ⅰ類抗原遞呈分子)所遞呈的脂質(zhì)抗原α-GalCer[2]，這使得iNKT細(xì)胞在進(jìn)化過程中具有高度保守的特異性[3]。其次，iNKT細(xì)胞活化機(jī)制多樣，除了受α-GalCer活化外，iNKT細(xì)胞組成性表達(dá)IL-12R和IL-18R，可被微環(huán)境中IL-12和IL-18激活，此外通過Toll樣受體信號刺激APC途徑也可介導(dǎo)iNKT細(xì)胞活化[4]。第三，iNKT細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，活化后的iNKT細(xì)胞能迅速分泌大量的細(xì)胞因子，如IFNγ、TNFα等，促使APC的活化，特別是誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的成熟，DC通過上調(diào)共刺激因子(CD40、CD80、CD86)表達(dá)，并通過分泌IL-12和IL-18分別與iNKT細(xì)胞表面的CD40L、IL-12R和IL-18R結(jié)合進(jìn)一步促使iNKT細(xì)胞活化[5]。更重要的是，iNKT細(xì)胞自身分泌的IFNγ及DC來源的IL-12、IFNγ可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞活化，因此iNKT細(xì)胞被喻為連接先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁[6]。最后，iNKT細(xì)胞自身還可以通過CD1d、穿孔素、顆粒酶及Fas/FasL等途徑直接殺傷靶細(xì)胞[7]，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

更為特殊的是，iNKT細(xì)胞是組織歸巢和組織常駐細(xì)胞，根據(jù)特定表面標(biāo)志物和特定轉(zhuǎn)錄因子可以劃分出不同功能的iNKT細(xì)胞亞群，如NKT1(分泌IFNγ為主)、NKT2(分泌IL-4為主)、NKT17(分泌IL-17為主)及NKT10(分泌IL-10為主)等亞群[8]，這些亞群在胸腺分化發(fā)育早期即出現(xiàn)，從胸腺出來以后以組織特異性方式歸巢在外周器官，在肝臟中最為豐富，其次是胸腺、肺、脾[9]，這主要是由于iNKT細(xì)胞的組織歸巢和組織定居特性所決定的。這些iNKT細(xì)胞亞群能夠分泌不同的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)不同組織定位的免疫反應(yīng)。且不同組織定位的iNKT細(xì)胞亞群表達(dá)的趨化因子受體也有所差異[10-12]，例如，肝內(nèi)的iNKT細(xì)胞表達(dá)高水平的CXCR3、CCR5及CCR2，其中CCR2及CCR5是炎癥相關(guān)趨化因子受體，為iNKT細(xì)胞向肝內(nèi)遷移及iNKT細(xì)胞調(diào)節(jié)肝內(nèi)免疫反應(yīng)提供了重要作用[13]，進(jìn)一步提示了iNKT細(xì)胞亞群可能以不同組織為靶點(diǎn)，發(fā)揮不同的免疫功能。這種組織特異分布方式也反映出iNKT細(xì)胞在肝臟生理及病理狀態(tài)下的免疫微環(huán)境中扮演著重要的角色，包括維持免疫耐受、微生物感染、自身免疫性疾病和癌癥等[14]。

2 iNKT細(xì)胞在肝臟免疫中的作用

肝臟是一個(gè)獨(dú)特的免疫器官，含有豐富的免疫細(xì)胞，包括Kupffer細(xì)胞(KC)、DC、NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，其中T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞約占肝內(nèi)淋巴細(xì)胞的90%[15]。正常情況下，iNKT細(xì)胞在肝竇內(nèi)巡邏，在那里含有豐富的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及KC，狹小的肝竇不僅減緩了血液流動(dòng)，肝竇內(nèi)皮的單層窗孔結(jié)構(gòu)進(jìn)一步促進(jìn)了iNKT細(xì)胞及KC捕捉病原體和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的能力[16]。值得注意的是，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、KC等肝內(nèi)APC表達(dá)高水平的CXCL16，吸引更多的CXCR6+iNKT向肝內(nèi)募集，CXCR6/CXCL16的相互作用也是肝內(nèi)iNKT細(xì)胞排斥異物分子的基礎(chǔ)，CXCR6的缺失會(huì)減弱iNKT細(xì)胞對肝臟的保護(hù)作用[17-18]。此外，如上所述，肝內(nèi)iNKT細(xì)胞表達(dá)豐富的CCR2、CCR5、CXCR3等趨化因子受體，會(huì)吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)向肝內(nèi)募集，引起肝內(nèi)炎性免疫反應(yīng)[19]，增加組織損傷風(fēng)險(xiǎn)。正常的肝臟如何能在肝臟不斷識別病原體外，還能保持肝內(nèi)免疫系統(tǒng)平衡，這與免疫耐受形成有關(guān)，將在后文進(jìn)行探討。

肝臟是雙血管供血系統(tǒng)，接受營養(yǎng)豐富的門靜脈(75%)和富氧的肝動(dòng)脈(25%)的雙重血液供應(yīng)。門靜脈結(jié)構(gòu)的存在使得肝臟除接觸外周血液中病原體外，還可以通過門靜脈吸收來自腸道的病原體[20]。肝臟在長期面對大量外來抗原的負(fù)荷下，為防止于外來抗原導(dǎo)致的自身肝損傷，iNKT細(xì)胞通過下調(diào)TCR或者上調(diào)程序性死亡-1(programmed cell death-1，PD-1)受體的表達(dá)、促進(jìn)其胞內(nèi)信號分子泛素化、分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10及TGFβ等途徑抑制機(jī)體免疫反應(yīng)[21-22]，使正常的肝臟呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)，從而維持正常肝內(nèi)免疫平衡，以保證肝臟在不斷的細(xì)胞因子刺激下免受損傷。此外，研究[23]表明，CXCR6/CXCL16的相互作用不僅是肝臟免疫識別反應(yīng)的重要基礎(chǔ)，也是iNKT細(xì)胞介導(dǎo)的維持免疫耐受，減少組織損傷的前提。由此可見肝臟的解剖及功能結(jié)構(gòu)、iNKT細(xì)胞在微環(huán)境中與其他細(xì)胞復(fù)雜的相互作用共同創(chuàng)造了肝內(nèi)特殊微環(huán)境，這種微環(huán)境決定了健康肝臟和炎癥之間的平衡。現(xiàn)已有研究[24]表明，肝內(nèi)免疫失調(diào)是肝臟疾病發(fā)生的標(biāo)志，免疫細(xì)胞的數(shù)量、分化及功能狀態(tài)均與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而iNKT細(xì)胞可以通過多種途徑維持肝內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)，由此推斷iNKT細(xì)胞的變化與肝內(nèi)疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。例如，Kaneko等[25]證實(shí)iNKT細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞表面FasL的表達(dá)，促進(jìn)穿孔素、顆粒酶及TNFα釋放并誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡，加重自身免疫肝炎的肝組織損傷，而Vα14NKT表達(dá)缺陷可以減輕對肝臟的損傷；由于飲酒過度激活iNKT細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子大量釋放及炎性細(xì)胞的聚集，加劇了肝組織損傷及肝細(xì)胞死亡[26]，促進(jìn)了酒精性肝病的進(jìn)展，而iNKT缺陷小鼠的肝組織損傷程度明顯減緩[27]。盡管iNKT細(xì)胞活化在某些程度上可以加重肝組織損傷，但更多的研究證實(shí)iNKT細(xì)胞還具有抗炎和保護(hù)肝臟的作用，例如在HBV/HCV感染的肝炎過程中，活化的iNKT細(xì)胞通過分泌IFNγ，抑制HBV/HCV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用[28-29]；此外，HCC是肝臟各類疾病進(jìn)展的最終結(jié)局，研究表明iNKT細(xì)胞的數(shù)量與功能障礙與HCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，Zahran等[30]通過流式細(xì)胞術(shù)證明HCC患者中外周血iNKT細(xì)胞表達(dá)頻率較正常人群明顯降低，且肝癌組織iNKT細(xì)胞數(shù)量及分泌IFNγ的功能顯著低于癌旁組織[31]，Xiao等[32]證實(shí)肝腫瘤的iNKT細(xì)胞和IFNγ表達(dá)是HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子，iNKT細(xì)胞減少會(huì)顯著增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，而iNKT細(xì)胞的增加則會(huì)減弱這種轉(zhuǎn)移概率[18,30]，提示iNKT細(xì)胞在抗HCC中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

3 iNKT細(xì)胞在HCC中抗腫瘤的作用機(jī)制

HCC通常繼發(fā)于病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等炎癥性肝病，是危害人類健康最嚴(yán)重的癌癥之一。由于HCC惡性程度高并且發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已為晚期，手術(shù)(切除、消融)及靶向藥物等治療很難阻止疾病進(jìn)展，目前已有研究支持活化的iNKT細(xì)胞對腫瘤微環(huán)境的多種免疫細(xì)胞具有重要的調(diào)控作用，且這種復(fù)雜作用的結(jié)局將導(dǎo)致對HCC細(xì)胞的殺傷作用。最初，Miyagi等[33]發(fā)現(xiàn)在HCC小鼠體內(nèi)通過α-GalCer直接誘導(dǎo)iNKT細(xì)胞活化，可以增加NK細(xì)胞對肝內(nèi)腫瘤的殺傷作用。但后來人們發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者的iNKT細(xì)胞對α-Galcer的反應(yīng)比正常人群低，體內(nèi)直接誘導(dǎo)iNKT增殖并活化存在一定缺陷[34]。于是Margalit等[35]通過在體外擴(kuò)增iNKT細(xì)胞并回輸給肝細(xì)胞癌小鼠，觀察到血清IFNγ、IL-12及IL-4顯著升高，外周血CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)升高，腫瘤生長受到抑制。研究學(xué)者[36]也在其他腫瘤中證實(shí)了iNKT細(xì)胞可以通過逆轉(zhuǎn)免疫抑制性的微環(huán)境中NK細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞活性，間接殺傷MHC陰性或者陽性的腫瘤細(xì)胞，大大增加了體內(nèi)的抗腫瘤活性。

研究[37]表明，HCC患者抗腫瘤免疫反應(yīng)低下除了因?yàn)镹K、CD8+T淋巴細(xì)胞衰竭外，往往還伴隨著免疫抑制性細(xì)胞，如MDSC及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的富集和抑制性免疫檢查點(diǎn)，如PD-1及其配體PD-L1等上調(diào)抑制了機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。iNKT細(xì)胞除了逆轉(zhuǎn)NK及CD8+T淋巴細(xì)胞活性外，還可以在免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境中拯救MDSC對T淋巴細(xì)胞的抑制程度[38]，促使MDSC表型發(fā)生改變(CD11b表達(dá)下降，CD86表達(dá)升高)，減弱MDSC的抑制作用，并且可能增加抗原遞呈細(xì)胞的作用達(dá)到抗腫瘤效果[39]。此外，Hix等[40]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明Vα14 NKT 細(xì)胞還可以通過CD1d依賴方式識別并殺傷腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，從多方面抑制腫瘤生長，發(fā)揮抗腫瘤作用。

目前，隨著抗PD-1單克隆抗體廣泛用于原發(fā)性肝癌臨床治療，大部分患者漸漸出現(xiàn)耐藥，Bae等[41]發(fā)現(xiàn)iNKT細(xì)胞的活化能夠在抗PD-1耐藥模型中顯著抑制腫瘤生長，逆轉(zhuǎn)免疫抑制抗腫瘤藥物位點(diǎn)耐藥，為耐藥患者的治療帶來了希望。這也為iNKT細(xì)胞聯(lián)合抗PD-1藥物治療HCC提供了可能。此外，嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的發(fā)展進(jìn)一步擴(kuò)展了iNKT細(xì)胞在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用，因?yàn)檠芯勘砻骶哂泄泊碳そY(jié)構(gòu)域的CAR能促進(jìn)iNKT細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子，并且增加其發(fā)揮抗腫瘤能力的持久性[42]。CAR-iNKT細(xì)胞治療可以彌補(bǔ)CAR-T在治療HCC中的不足[43]：(1)滲透性弱，不能有效地歸巢肝臟；(2)受到MDSC及PD-1表達(dá)等塑造的免疫抑制微環(huán)境影響不能有效發(fā)揮作用；(3)未利用NK細(xì)胞的殺傷活性，“一拳難敵四手”?；趇NKT細(xì)胞的免疫治療恰好可以改善這種問題，能從恢復(fù)NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞活性及干擾免疫抑制性細(xì)胞雙方面糾正HCC固有的免疫功能低下，恢復(fù)機(jī)體細(xì)胞毒性細(xì)胞功能。雖然在HCC研究方面，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道仍較少，但總之，iNKT細(xì)胞可以從多方面改善HCC微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，從而增加機(jī)體抗腫瘤活性。

4 結(jié)語

綜上所述，iNKT細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)特性，是肝臟免疫系統(tǒng)的參與者與守護(hù)者，不僅對調(diào)節(jié)正常肝臟的免疫反應(yīng)具有重要意義，也在各類肝臟疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，尤其能夠在肝臟抗腫瘤免疫中逆轉(zhuǎn)CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞衰竭，并且對腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制性細(xì)胞具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這為HCC的治療提供了新方向。然而關(guān)于iNKT細(xì)胞的研究大多數(shù)均來自動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，尚需更多的臨床研究。且該免疫療法采用自體回輸，其治療效果取決于多重因素，包括iNKT細(xì)胞亞群功能，體外擴(kuò)增數(shù)量，注射劑量、頻率及個(gè)體中腫瘤微環(huán)境差異等，因此在研究中需要考慮到以下幾點(diǎn)：(1)人類中的iNKT細(xì)胞表型多變，功能也很豐富，如何使其在發(fā)揮抗腫瘤過程中加強(qiáng)分泌Th1型細(xì)胞因子，或者找出其中一個(gè)具有更長發(fā)揮時(shí)效的iNKT細(xì)胞亞群以達(dá)到更好的治療效果；(2)iNKT細(xì)胞的組織特異性分布原因尚且不清楚，是否可以從了解組織分布特異性機(jī)制方面去找出一種利于iNKT細(xì)胞向肝臟遷移的基因，利用攜帶這種基因的iNKT細(xì)胞實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向治療使其更具療效：(3)雖然有證據(jù)表明iNKT細(xì)胞可以自然遷移到肝臟中，但尚無有力證據(jù)表明iNKT細(xì)胞可以遷移到肝臟腫瘤細(xì)胞表面，是否可以通過制備靶向腫瘤抗原的iNKT細(xì)胞精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫。這些均需要在研究中進(jìn)行不斷探索，相信通過不斷優(yōu)化iNKT細(xì)胞回輸?shù)臈l件，該免疫治療是實(shí)現(xiàn)成功的抗HCC免疫最具前景的治療方式。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡想金負(fù)責(zé)文章寫作思路并撰寫論文;高耀負(fù)責(zé)修改論文; 閭軍負(fù)責(zé)指導(dǎo)并最后定稿。