吳 雨，錢平安，范興良，祝峻峰

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院 肝病科，上海 201203

肝細胞癌(HCC)是目前我國常見的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿、發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高，被公認為重大疑難疾病[1]。在肝癌進展中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在轉(zhuǎn)移的早期階段起關(guān)鍵作用。EMT賦予細胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，包括干細胞特征、減少凋亡，促進免疫抑制，不僅在發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的作用，并且參與癌癥的發(fā)生過程。受體酪氨酸激酶Axl與EMT密切相關(guān)，直接影響間質(zhì)狀態(tài)并賦予其侵略性表型，在EMT介導(dǎo)的致癌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制Axl可逆轉(zhuǎn)EMT。在肝癌細胞發(fā)生EMT過程中，Axl結(jié)合支架蛋白14-3-3ζ是TGFβ1介導(dǎo)HCC發(fā)生發(fā)展的必要條件[2]。故靶向抑制Axl成為腫瘤治療的新策略[3]。

1 Gas6/Axl在肝臟中的生物學(xué)特性

1.1 受體與配體 Axl是一種酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinases，RTK)，屬于腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)家族，由Tyro-3、Axl和Mer組成。TAM受體包含兩個免疫球蛋白樣(Ig)結(jié)構(gòu)域，其胞外結(jié)構(gòu)域中包含兩個纖連蛋白3型(FNⅢ)部分，激酶結(jié)構(gòu)域中包含保守氨基酸序列KW(I/L)A(I/L)ES[4]。人類Axl基因位于染色體19q13.2上，由20個外顯子編碼，形成由894個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Axl被翻譯后糖基化形成120 kD(部分糖基化形式)或140 kD的蛋白質(zhì)。Gas6和ProS是TAM的配體，其中Gas6與Axl的親和力最高，而ProS主要與Tyro3和Mer結(jié)合Axl通過維生素K翻譯修飾后具有生物活性[5]。

Gas6介導(dǎo)的Axl二聚化分兩步進行，首先Axl免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域與Gas6的層狀蛋白G樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得Gas6與Axl以1∶1的比例連接，形成高親和力的Gas6/Axl復(fù)合物，而后這種復(fù)合物橫向擴散，形成Axl同源二聚體化復(fù)合物[6]。Axl可介導(dǎo)細胞增殖，依賴于MAPK/ ERK途徑，并涉及PI3K和c-Jun-N-JNK的激活。Ras、Twist和NF-κB是Axl的下游靶標[7]。微環(huán)境因素(例如缺氧)激活A(yù)xl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以驅(qū)動血管生成[8]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIF)-1和HIF-2可結(jié)合到小鼠體內(nèi)Axl近端啟動子的缺氧反應(yīng)元件上，導(dǎo)致HCC中Axl的轉(zhuǎn)錄激活[9]。Axl的另一個上游調(diào)節(jié)劑是RAB10，在HCC患者中其與腫瘤大小和晚期腫瘤的分期有關(guān)[10]。在HCC進展中，Axl由Hippo/YAP信號上調(diào)和誘導(dǎo)，增強了肝腫瘤的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移作用[11]。

1.2 Gas6/Axl在HCC中的作用 Axl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常會引起炎癥、自身免疫性疾病和癌癥[6]。Gas6/Axl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有助于腫瘤細胞在凋亡刺激的應(yīng)答中存活[6,12]。Axl及配體Gas6浸潤在由腫瘤細胞、脈管系統(tǒng)、白細胞和骨髓祖細胞組成的腫瘤微環(huán)境中[13]。在HCC中，Gas6/Axl信號通路可通過激活slug促進腫瘤侵襲[14]。同時，Axl也是EMT和化學(xué)抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15]。在HCC中，由于TGFβ的協(xié)同作用，肝腫瘤細胞經(jīng)歷EMT、Axl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致腫瘤細胞侵襲/轉(zhuǎn)移[2]。在這個過程中，Gas6/Axl與支架蛋白14-3-3ζ結(jié)合后激活JNK，JNK通過Smad3接頭區(qū)域的異常磷酸化和促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄，將TGFβ轉(zhuǎn)換為腫瘤進展功能基因。

2 Gas6/Axl信號通路與HCC的EMT過程

2.1 EMT與HCC EMT是指上皮細胞在特定的生理或病理條件下失去上皮特性，獲得間質(zhì)細胞表型的一種生物現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為細胞遷移性和侵襲性、誘導(dǎo)干細胞特性等。EMT是可逆的，其反向過程被稱為MET[16]。根據(jù)組織環(huán)境或激活信號，在EMT的過程中，上皮細胞可能失去部分特征，存在中間狀態(tài)(EMTed)，具有上皮和間充質(zhì)表型的屬性，并且還表現(xiàn)出干細胞樣的特性，顯示出高度的可塑性，并在癌癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[17]。腫瘤內(nèi)存在自我更新的干細胞樣細胞，稱為“腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)” ，EMT過程使癌細胞在腫瘤發(fā)展過程中擴散和自我更新，分化的癌細胞向腫瘤干細胞轉(zhuǎn)變，并產(chǎn)生致癌突變，通過EMT過程整合到腫瘤干細胞中[18]。在許多類型的癌癥中，干細胞已經(jīng)通過表觀遺傳程序與EMT表型聯(lián)系起來。同樣，HCC中也出現(xiàn)具有EMT/MET類型的腫瘤干細胞。在腫瘤侵襲前的HCC患者樣本中，觀察到具有間充質(zhì)表型的干細胞[19]。有研究[20]用免疫組化法檢測27例HCC患者上皮細胞和腫瘤干細胞標志物的表達，發(fā)現(xiàn)63%的患者上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，81%的患者上皮細胞標志物N-鈣黏蛋白表達上調(diào)，78%的患者CSC標記CD13上調(diào)，表明EMT可以促進HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與HCC的預(yù)后和治療有著密切的關(guān)系[21]。

2.2 Axl與HCC的EMT過程 大多數(shù)腫瘤靶向治療是通過抑制RTK或其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制細胞的生長和侵襲[22]。Axl是屬于RTK家族的跨膜糖蛋白，最初從慢性髓細胞白血病患者中分離得到。正常生理條件下，Axl表達于包括大腦在內(nèi)的各種器官中，參與間質(zhì)細胞和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[23]。而在腫瘤進程中，Axl的過表達與腫瘤患者的生存率相關(guān)，可在多種類型的癌癥中檢測到[4]。已發(fā)現(xiàn)Axl的過表達與多種癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[24]。癌癥中的Axl信號參與上皮細胞真核轉(zhuǎn)化[25]，其中極化的上皮細胞失去其連接完整性，變成能動的、侵襲性的間充質(zhì)細胞[26]。在643種人類癌細胞系中，檢測到Axl表達升高與間充質(zhì)表型呈正相關(guān)[27]。

在EMT的過程中，Axl是EMT的重要下游調(diào)節(jié)劑，是許多惡性腫瘤轉(zhuǎn)移擴散的必需條件[25,28]。而在HCC的EMT過程中，Axl是腫瘤侵襲的決定因素[2,14]，在這個過程中，基因表達主要受轉(zhuǎn)錄因子Slug調(diào)控，Snail和Twist賦予腫瘤細胞運動性，并通過E-cadherin抑制及Vimentin過表達達到侵襲和轉(zhuǎn)移的目的[29]。敲除Axl可導(dǎo)致間充質(zhì)HCC細胞喪失侵襲和內(nèi)皮遷移的能力，以及上皮性HCC細胞失去由于Axl過表達誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移能力[2]。HCC細胞的局部浸潤和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與EMT相關(guān)，TGFβ在早期腫瘤發(fā)展過程中具有抑制腫瘤的作用，但在晚期，肝腫瘤細胞可通過拮抗細胞生長抑制作用和細胞毒性作用誘導(dǎo)EMT，激活晚期HCC中TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致HCC的進一步發(fā)展[30]。Reichl等[2]發(fā)現(xiàn)Axl信號是TGFβ介導(dǎo)HCC進展的關(guān)鍵，Axl信號導(dǎo)致Smad3L的異常磷酸化、前轉(zhuǎn)移靶基因的誘導(dǎo)以及TGFβ的分泌增加，進而激活TGFβ的促腫瘤靶基因、纖溶酶原激活物抑制劑1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9和Snail。

2.3 Gas6/Axl信號通路與HCC的EMT過程 Axl的致癌潛能在酪氨酸激酶域內(nèi)，可通過結(jié)合配體Gas6，激活其酪氨酸激酶活性，進而活化下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細胞的增殖、黏附和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[31]。此過程中Gas6/Axl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必須與14-3-3ζ結(jié)合，并作用于下游信號。14-3-3ζ蛋白參與各種細胞過程的信號成分結(jié)合[32]，其與靶標之間的相互作用主要由結(jié)合蛋白的磷酸化介導(dǎo)。在HCC中，可觀察到14-3-3ζ的過表達[33]，14-3-3ζ在復(fù)合αB-晶狀體蛋白中誘導(dǎo)HCC細胞的EMT發(fā)生[34]。14-3-3ζ充當Gas6/Axl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的支架蛋白，siRNA對14-3-3ζ的干擾減弱了間充質(zhì)3sp細胞以及過表達Axl的3sp細胞中Gas6/Axl依賴性的遷移和侵襲反應(yīng)，表明Axl必須與14-3-3ζ相互結(jié)合激活下游信號[2]。由Gas6/Axl激活的下游途徑包括PI3K/Akt途徑[35]、MAPK/ERK途徑[36]和Ral GTPase蛋白途徑[37]。

在HCC的EMT過程中，有多條信號通路起作用，包括RTK通路、TGFβ通路Wnt通路以及Hedgehog通路等。TGFβ通路被認為是參與EMT過程中最具影響力的信號通路。典型的TGFβ信號通路被激活后，三個亞型之一(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)與TGFβ受體Ⅱ(TGFβRⅡ)結(jié)合，激活TGFβ受體Ⅰ，形成TGFβRⅡ/Ⅰ異源二聚體，進一步啟動下游多個信號通路，包括依賴Smads的通路和非依賴Smads的通路。在腫瘤環(huán)境下，依賴Smads通路調(diào)節(jié)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括Snail、Slug、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、Twist等，通過促進腫瘤血管生成、免疫抑制及EMT的發(fā)生等，增強腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當HCC進展中發(fā)生EMT時，Gas6/Axl/14-3-3ζ信號激活JNK，磷酸化TGFβ通路中Smad3連接區(qū)的絲氨酸-123殘基，促進TGFβ靶基因如PA1、MMP9和Slug的上調(diào)，以及間充質(zhì)HCC細胞中TGFβ1分泌的增加，導(dǎo)致間充質(zhì)HCC的侵襲性表型增強[2]。敲除Axl或14-3-3ζ可消除Smad3L磷酸化的影響。

3 Axl在HCC診斷中的應(yīng)用

早期HCC的準確檢測和鑒別診斷可以顯著提高患者的生存率，目前在臨床實踐中HCC的檢測主要通過診斷成像技術(shù)和血清生物標志物的測定，代表的血清標志物是AFP。然而在HCC的早期階段，AFP的靈敏度僅為18%～60%，特異度有限。因此，一些其他的生物標記已被用來補充和增加HCC檢測的準確性，其中最常用的是去-γ-羧基凝血酶原、AFP-L3、骨橋蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和高爾基蛋白-73[38]。但關(guān)于這些標志物性能的報道是相互矛盾的，Meta分析[39]顯示，去-γ-羧基凝血酶原和AFP-L3的表現(xiàn)都不如AFP。

Axl通過其配體Gas6與胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合被激活，導(dǎo)致下游靶標的磷酸化，胞外結(jié)構(gòu)域可被MMP處理，釋放出一種可在血清中檢測到的80 kD可溶性蛋白(sAxl)[40]。因此在一項涉及中國和歐洲患者的多中心研究[41]中，討論了sAxl作為HCC非侵入性生物標志物的潛力，對311例HCC患者的血清進行了分析。根據(jù)BCLC標準，將患者分為極早期、早期和晚期HCC。與健康或肝硬化對照者相比，在所有的HCC患者 (18.575 ng/ml)、極早期的HCC患者(18.064 ng/ml)和早期的HCC患者 (16.430 ng/ml)中發(fā)現(xiàn)了顯著增加的sAxl水平，在HCC晚期，觀察到sAxl水平進一步上升(18.880 ng/ml)，表明在各期HCC患者血清中均可檢測到sAxl的水平明顯增加。并且在極早期的AFP陰性患者中，sAxl顯示出更高的靈敏度(80%)和特異度(69.2%)。在HCC與肝硬化的鑒別診斷中，sAxl (AUC=0.815)也優(yōu)于AFP (AUC=0.771)，并且與AFP (55.3%)相比顯示出更高的敏感度(78%)。在患有乳腺癌、卵巢癌或結(jié)腸直腸癌的患者中，sAxl水平并沒有變化，從而證明了sAxl作為HCC生物標志物的特定作用。結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移不會改變sAxl的血清水平，因此可以區(qū)分HCC和繼發(fā)性的肝臟惡性腫瘤。總之，與單用AFP相比，sAxl在檢測HCC的早期階段顯示出了較高的靈敏度。sAxl和AFP的結(jié)合進一步提高了診斷效率，并在HCC和肝硬化的鑒別診斷中顯示出較高的準確性。此外，sAxl在AFP陰性的HCC患者中表現(xiàn)良好。因此sAxl是篩選早期HCC的潛力候選生物標志物之一。

4 Axl及其抑制劑在HCC治療中的應(yīng)用

Axl與多種惡性腫瘤分子靶向治療獲得性耐藥的發(fā)展有關(guān)，也是抗血管生成藥和多靶點激酶抑制劑適應(yīng)性耐藥的關(guān)鍵[42]。Axl及其主要配體Gas6在許多人類癌癥(如肺癌、乳腺癌和胰腺癌)中過度表達和活化，并與不良預(yù)后、促進侵襲性/轉(zhuǎn)移、EMT表型和耐藥性相關(guān)。在不同的模型系統(tǒng)中單獨或與其他藥物聯(lián)合，使用特定的小分子激酶抑制劑或抗體來靶向Axl，可導(dǎo)致Axl介導(dǎo)的信號通路失活，重新獲得藥物敏感性和提高治療效果，因此將Axl定義為癌癥治療的有希望的新靶點。Pinato等[43]使用R428測試了Axl抑制的細胞毒性潛力，R428是一種Axl特異性小分子抑制劑，在體內(nèi)外均具有抗腫瘤功效。使用SRB分析，證實在連續(xù)暴露于藥物72 h后，R428在一組HCC細胞系的微摩爾范圍內(nèi)發(fā)揮生長抑制作用。由于R428是一種選擇性的具有Axl抑制特性的酪氨酸激酶抑制劑，利用細胞增殖、運動和侵襲能力等實驗表明，通過基因下調(diào)和R428的藥理學(xué)抑制，對Axl進行治療性調(diào)節(jié)，可影響HCC的進展。越來越多的證據(jù)表明，Axl是多靶點酪氨酸激酶抑制劑的主要調(diào)節(jié)因子，推測Axl磷酸化可能在機制上參與了索拉非尼耐藥性的發(fā)生。R428對索拉非尼具有誘導(dǎo)生長抑制和促凋亡潛能的增量效應(yīng)，使得Axl抑制劑在晚期HCC一線治療上具有一定的開發(fā)前景，在患者因肝功能障礙或癥狀性進展而面臨無法治療之前，延長無進展生存期。

5 展望

在HCC中，Gas6/Axl軸過度表達/過度激活可導(dǎo)致其進展，包括影響侵襲、轉(zhuǎn)移、化療以及靶向抗癌的治療，表明Gas6/Axl通路是潛在的癌癥治療靶點。對于這條通路的抑制可以通過多種方式實現(xiàn)，例如使用Axl酪氨酸激酶抑制劑、靶向Axl/MET/EGFR界面的藥物及其下游信號效應(yīng)子，或者通過使用針對Gas6和Axl的阻斷抗體。已有多家藥物公司正在進行多種抑制劑的臨床開發(fā)，這些抑制劑或是專門針對Axl，或者是針對Axl的具有良好效力的多靶點激酶抑制劑[44]。

Axl在HCC診斷中的前景，體現(xiàn)在其釋放的可溶性蛋白sAxl可作為HCC早期診斷的標志物。sAxl的水平反應(yīng)肝臟疾病的進展過程，對患者進行分層，利于HCC和肝硬化的鑒別，表明Axl和sAxl有作為精確診斷HCC標志物的潛力。在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，EMT促進HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，而Axl作為EMT的重要下游調(diào)節(jié)劑，是腫瘤侵襲的決定性因素。目前對于Axl活化在HCC發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等多個方面的研究取得了一些進展。但仍需解決一些問題，如Axl抑制在阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用之外如何影響癌癥免疫？Axl/Gas6抑制劑通過什么機制發(fā)揮抗癌作用？由于Axl在癌癥發(fā)生、侵襲/轉(zhuǎn)移/EMT和耐藥性等背景中的作用，在臨床研究中，需要結(jié)合特定情況，仔細評估這些因素。隨著對Gas6/Axl信號通路研究的不斷深入，其可為HCC的早期診斷和治療提供新的思路，而其在腫瘤EMT中的作用機制和對基因表達的調(diào)控，不僅為抗HCC治療提供新的研究方向，也可推及至其他類型的腫瘤，為進一步研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制奠定基礎(chǔ)。

作者貢獻聲明：吳雨擬定寫作思路，撰寫論文及修改；錢平安、范興良參與資料收集；祝峻峰指導(dǎo)文章修改。