許燕楠，劉 平，慕永平

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病二科，上海中醫(yī)藥大學(xué) 肝病研究所，上海 201203

肝纖維化的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的病理過(guò)程，從組織病理學(xué)角度來(lái)說(shuō)，肝纖維化是慢性肝損傷條件下的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，由于瘢痕組織形成改變了正常的肝臟結(jié)構(gòu)和血液供應(yīng)，導(dǎo)致肝功能障礙[1]。從細(xì)胞角度來(lái)說(shuō)，慢性肝損傷導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的死亡(壞死、凋亡)、Kupffer細(xì)胞活化等導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，并向肌成纖維細(xì)胞分化，導(dǎo)致組織中實(shí)質(zhì)細(xì)胞被纖維細(xì)胞替代[2]。從分子角度來(lái)說(shuō)，肝纖維化形成過(guò)程中涉及多種細(xì)胞因子，包括促炎因子、促纖維化因子等以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變?；?qū)用姘ńM蛋白乙?；揎?，DNA甲基化在內(nèi)的表觀遺傳也與肝纖維化密切相關(guān)[3]。目前，從分子水平探索肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，并基此開展靶向藥物的研發(fā)顯得越發(fā)重要。Numb是一個(gè)進(jìn)化保守的基因，具有控制細(xì)胞不對(duì)稱分裂和細(xì)胞命運(yùn)選擇、胞吞作用、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、特定底物泛素化及多種信號(hào)通路等復(fù)雜的功能[4-5]。盡管哺乳動(dòng)物中Numb基因的表達(dá)模式強(qiáng)烈提示其在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但該基因也在大多數(shù)成體和胚胎組織中表達(dá)，表明其作用并不局限于神經(jīng)發(fā)育[4]，目前研究較多的是其在腫瘤領(lǐng)域的治療機(jī)制。也有研究[6]發(fā)現(xiàn)Numb在纖維化發(fā)生中也發(fā)揮重要作用，比如在腎纖維化中，Numb失去其特有的膜定位無(wú)法抑制Notch信號(hào)通路，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞的死亡，加重纖維化進(jìn)程。但尚不明確，Numb基因經(jīng)選擇性剪切后翻譯的Numb蛋白不同亞型在纖維化疾病中扮演怎樣的角色。本文綜述了Numb蛋白各亞型的功能特點(diǎn)以及其在肝纖維化中的潛在應(yīng)用前景。

1 Numb及其不同亞型的產(chǎn)生

Numb最早在果蠅感覺(jué)器官前體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[7]，其具有不對(duì)稱分布和調(diào)控不對(duì)稱分裂的特性，從而決定子代細(xì)胞命運(yùn)，是重要的細(xì)胞命運(yùn)決定因子。哺乳動(dòng)物中的Numb表現(xiàn)出更為復(fù)雜的功能模式，主要與其在脊索動(dòng)物譜系的共同祖先中獲得外顯子3(Exon3)有關(guān)，Exon3編碼位于Numb蛋白N端的11個(gè)氨基酸，從而產(chǎn)生2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：含有Exon3或不含Exon3的磷酸酪氨酸(phosphotyrosine binding，PTB)結(jié)構(gòu)域，自Exon3出現(xiàn)以來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)Numb蛋白的PTB結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合多種蛋白質(zhì)的功能，也參與部分細(xì)胞膜定位與調(diào)控胞吞和信號(hào)通路的作用[8]。另一個(gè)重要的功能域是富含脯氨酸區(qū)域(proline rich region，PRR)，其中包含外顯子9(Exon 9)編碼的48個(gè)氨基酸，不僅參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，也與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)[10]。Numb 4種主要亞型的產(chǎn)生就在于對(duì)Exon3和 Exon9的選擇性剪切，根據(jù)PTB和PRR結(jié)構(gòu)域是否包含11個(gè)氨基酸片段和48個(gè)氨基酸片段，將Numb蛋白分為4個(gè)亞型：Numb1 (Nbp72)，擁有完整的PTB和PRR結(jié)構(gòu)域(PTBL, PRRL)；Numb2 (Nbp66)，缺失PRR結(jié)構(gòu)域(PRRS)；Numb3 (Nbp71)，缺失PTB結(jié)構(gòu)域(PTBS)；Numb4 (Nbp65)，既缺失PTBS又缺失PRRS[11]。這些亞型在調(diào)節(jié)信號(hào)通路與細(xì)胞功能方面發(fā)揮著截然不同的作用，可能為疾病治療提供不同的分子靶點(diǎn)。

2 不同亞型Numb蛋白與肝纖維化的關(guān)系

目前Numb在肝纖維化中的研究尚少，其剪接變異的存在及其確切調(diào)控的生理相關(guān)性更是鮮為人知。有研究[12]認(rèn)為，Numb可以促進(jìn)纖維化肝臟的肝細(xì)胞再生，也有研究[13]發(fā)現(xiàn)微小RNA148a可顯著上調(diào)Numb的表達(dá)，減輕肝癌小鼠的肝纖維化程度，但其在抗肝纖維化效應(yīng)中的具體機(jī)制尚不明確。在分子水平上，Numb參與調(diào)控Notch、Hedgehog和p53依賴的信號(hào)通路[14]，鑒于這幾條信號(hào)通路與肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切[15]，以及Numb調(diào)控成體干細(xì)胞不對(duì)稱分裂的特性[16]，提示Numb有可能參與肝纖維化的病理進(jìn)程。由于不同亞型的Numb蛋白具有不同的功能，因此，其在調(diào)節(jié)信號(hào)通路與細(xì)胞增殖分化上也有所區(qū)別。故Numb亞型-信號(hào)通路-肝纖維化這三者之間的關(guān)系值得進(jìn)一步的研究和探討。

2.1 Numb亞型與Notch信號(hào)通路 Notch通路是一種保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，近年來(lái)，Notch信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)生中的作用及其機(jī)制受到廣泛關(guān)注。首先，HSC自身、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的Notch信號(hào)活化都會(huì)激活HSC[17-18]，使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。其次，Notch信號(hào)通路激活可促進(jìn)肝干細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化，促進(jìn)膽汁淤積性肝纖維化的進(jìn)展[19]。抑制Notch信號(hào)通路活化可抑制HSC活化以及肝纖維化進(jìn)展[20]。提示探尋抑制Notch信號(hào)通路活化的手段可能有助于肝纖維化的防治。

Numb作為Notch信號(hào)通路的重要負(fù)向調(diào)控因子，在細(xì)胞分裂過(guò)程中，遺傳Numb的細(xì)胞缺乏Notch活性，從而決定子代細(xì)胞命運(yùn)[21]，但Numb抑制Notch的確切機(jī)制尚不明確，可能通過(guò)內(nèi)吞作用[22]、泛素化途徑、靶向Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[23]或轉(zhuǎn)錄因子RBPJ-κ等[24]，且發(fā)現(xiàn)Numb亞型的切換可影響這一過(guò)程。有研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，含有Exon9的Numb亞型表達(dá)增加卻促進(jìn)了Notch信號(hào)活化，如在肺癌研究中，發(fā)現(xiàn)Numb2(PTBL/PRRS)表達(dá)增加可有效抑制Notch信號(hào)通路活化，但當(dāng)與擁有Exon9編碼的PRR結(jié)構(gòu)域的Numb1(PTBL/PRRL)拮抗后增加了Notch靶基因的表達(dá)[27]。除了Exon9，Exon3編碼的PTB結(jié)構(gòu)域的存在與否與Notch活性密切相關(guān)。在PC12細(xì)胞中，與擁有PTB結(jié)構(gòu)域的Numb亞型(Numb1和Numb2)相比，缺乏PTB結(jié)構(gòu)域(Numb3和Numb4)表現(xiàn)出更高的Notch活性[28]，這可能與泛素化途徑相關(guān)。

近年來(lái)，大量研究[29]表明，Numb和Notch之間的生物拮抗作用主要依賴于泛素化。一方面，E3泛素連接酶LNX可靶向Numb引起Numb自身的泛素化和降解，從而降低了對(duì)Notch的抑制作用[30]。研究[31]表明，雖然Numb的4種亞型均能與E3泛素連接酶LNX結(jié)合，但只有Numb1(PTBL/PRRL)和Numb2(PTBL/PRRS)被泛素化及降解，其關(guān)鍵機(jī)制在于LNX的PDZ1結(jié)構(gòu)域與PTB之間的相互作用。另一方面，E3泛素連接酶ITCH可引起Notch的泛素化，有研究[32]發(fā)現(xiàn)，刪除PTB結(jié)構(gòu)域C端的88個(gè)氨基酸后，其泛素化Notch的能力大大下降，表明Notch信號(hào)通路的泛素化需要一個(gè)完整的PTB結(jié)構(gòu)域與泛素連接酶結(jié)合。上述結(jié)果表明，含有PTB結(jié)構(gòu)域的Numb亞型可抑制Notch信號(hào)的活性，而PRR結(jié)構(gòu)域可能會(huì)破壞這種抑制機(jī)制。因此，基于Numb蛋白不同亞型與Notch信號(hào)通路的關(guān)系及Notch信號(hào)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用，研究Numb蛋白亞型在肝纖維化中的作用是十分有意義的，這可能為靶向分子治療肝纖維化提供一個(gè)新方向。

2.2 Numb亞型與P53通路 P53作為一種典型的抑癌基因，可通過(guò)凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[33]，目前也發(fā)現(xiàn)其對(duì)代謝相關(guān)脂肪性肝病[34]和肝纖維化[35]具有調(diào)控作用。其中在肝纖維化環(huán)境中可以調(diào)控HSC的活化與衰老[36]，可能與誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡相關(guān)[37]。其缺失可使HSC的凋亡減少而導(dǎo)致廣泛的肝纖維化[36,38]；其上調(diào)可促進(jìn)HSC衰老而降低纖維化程度[39]。而P53的穩(wěn)定離不開Numb的支持[8]。

P53被E3泛素連接酶MDM2結(jié)合并泛素化，從而調(diào)控其蛋白酶體降解，而Numb可以通過(guò)Exon3編碼的11個(gè)氨基酸短鏈與MDM2的酸性域結(jié)合并抑制MDM2，從而穩(wěn)定P53通路[8]。有研究[40]發(fā)現(xiàn)，敲除所有Numb亞型或只敲除Numb1/2可顯著降低P53的表達(dá)水平，而沉默Numb 3/4則沒(méi)有顯著影響，認(rèn)為只有含有完整PTB結(jié)構(gòu)域的Numb亞型才能阻止P53的泛素化和降解。因此，基于Numb1/2對(duì)P53的穩(wěn)定作用，P53對(duì)HSC的促凋亡效應(yīng)，各亞型Numb蛋白在肝纖維化的意義值得進(jìn)一步探究。

2.3 Numb亞型與Hedgehog信號(hào)通路 Hedgehog途徑是一種復(fù)雜的、受嚴(yán)格調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可簡(jiǎn)化為4個(gè)主要組件：Hedgehog配體、受體，信號(hào)轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子Gli[41]，在纖維化模型中，抑制Hedgehog信號(hào)通路可抑制HSC活化減輕肝纖維化[42]，而促進(jìn)其表達(dá)則激活HSC[43]，并促進(jìn)肝祖細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化進(jìn)而加重肝纖維化的進(jìn)展[44]。而該通路的抑制機(jī)制也有賴于Numb蛋白。

小干擾RNA (siRNA)介導(dǎo)的Numb敲除減少了內(nèi)源性Gli1的泛素化[45]，其機(jī)制與Notch信號(hào)通路的泛素化途徑類似，Numb可通過(guò)結(jié)合E3泛素連接酶ITCH靶向Gli1，促進(jìn)其泛素化，從而減少Hedgehog的表達(dá)[46]。如前所述，Numb與ITCH結(jié)合需要一個(gè)完整的PTB結(jié)構(gòu)域，故帶有PTB結(jié)構(gòu)域的Numb1與Numb2在抑制Hedgehog信號(hào)通路上可能具有更大貢獻(xiàn)。

3 Numb亞型對(duì)纖維化肝臟肝干細(xì)胞分化與增殖的潛在影響

干細(xì)胞是一類具有自我更新和向特定譜系分化潛能的細(xì)胞群，細(xì)胞對(duì)稱分裂和非對(duì)稱分裂是其特有的性征和再生的機(jī)制[47]。成體肝臟中存在可分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞譜系的雙潛能干細(xì)胞，又稱之為內(nèi)源性肝干細(xì)胞，在纖維化過(guò)程中其也可以分化為肌成纖維細(xì)胞[48]。故調(diào)控肝臟干細(xì)胞的增殖與分化可能為肝纖維化的治療提供更為理想的方案。

Numb具有不對(duì)稱分布和調(diào)控不對(duì)稱分裂的特性，從而調(diào)節(jié)胚胎和成年器官中干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖、分化，決定干細(xì)胞命運(yùn)和自我更新。與果蠅神經(jīng)干細(xì)胞分化相似，早期有研究[49]發(fā)現(xiàn)，在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，也因?yàn)镹umb的不對(duì)稱分裂，擁有Numb的子細(xì)胞可以抑制該子細(xì)胞的Notch活性從而誘導(dǎo)神經(jīng)元分化。而在肝纖維化中，抑制Notch信號(hào)通路可以抑制肝干細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化從而減輕纖維化程度[20]，且不同的亞型具有不同的功效。在癌癥研究中，PRRL促進(jìn)癌干細(xì)胞的增殖而非分化，PRRS則促進(jìn)其分化而非增殖[10]。如在肝細(xì)胞癌中，PRRL型Numb的表達(dá)高于PRRS型，促進(jìn)了肝癌干細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致預(yù)后不良[50]。目前尚未有Numb對(duì)肝干細(xì)胞不對(duì)稱分裂調(diào)節(jié)的直接證據(jù)，但可能具有潛在效應(yīng)。

4 小結(jié)

綜上所述，Numb是一個(gè)重要的細(xì)胞命運(yùn)決定子，因基因選擇性剪切Exon3或Exon9而主要產(chǎn)生4種亞型蛋白。盡管各亞型Numb蛋白與肝纖維化之間的關(guān)系尚未明確，但基于擁有的PTB結(jié)構(gòu)域的Numb1或Numb2可能通過(guò)與不同E3泛素連接酶結(jié)合促進(jìn)Notch、Hedgehog信號(hào)通路的泛素化，穩(wěn)定P53信號(hào)通路，以及調(diào)控肝干細(xì)胞的分化取向等研究證據(jù)，提出合理展望：Numb1或Numb2可能可以抑制肝纖維化進(jìn)展，但尚不清楚Numb3和Numb4是否會(huì)加重肝纖維化或不產(chǎn)生效果，因此圍繞Numb亞型探尋肝纖維化的潛在分子靶點(diǎn)是一個(gè)值得深入的新課題。簡(jiǎn)言之，調(diào)控Numb選擇性剪切，或提高Exon3的表達(dá)，可能成為肝纖維化治療的潛在手段。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：許燕楠負(fù)責(zé)收集查閱文獻(xiàn)并撰寫論文；劉平負(fù)責(zé)修改論文；慕永平負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。