孫 尚

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西 南昌 330045）

1.國(guó)內(nèi)外病原微生物研究進(jìn)展

植物病害會(huì)對(duì)林業(yè)產(chǎn)生一定的危害，例如造成板栗疫病、歐美楊細(xì)菌潰瘍病、柑橘黃龍病等森林病害，對(duì)林業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。植物病害常見的有侵染性病害和非侵染性病害，非侵染性病害由非侵染性病害(環(huán)境)因素引起的病害；侵染性病害是由生物性病原引起的病害，生物性病害病原可分為真菌性、細(xì)菌性、病毒性和螨類等。

傳統(tǒng)分類鑒定方法的相關(guān)研究一般依照柯赫式法則，通常是先取病葉通過(guò)組織分離法獲取病原微生物，通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料進(jìn)行分類鑒定，后通過(guò)回接試驗(yàn)引起寄主植物發(fā)病，而后將再分離出的微生物與接種微生物比較。這種方法是植物病理學(xué)上的經(jīng)典，沿用至今。如黃澤余等對(duì)廣西紅樹林真菌病害區(qū)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)病原真菌引起的葉部病害是紅樹林的主要病害。費(fèi)顯偉等對(duì)李樹細(xì)菌性穿孔病進(jìn)行病原鑒定，發(fā)現(xiàn)病原物為一種革蘭氏陰性細(xì)菌。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的技術(shù)在病原菌鑒定方面表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，為病原鑒定提供了提供了可靠手段。比如，劉鵬等根據(jù)病原菌的核糖體DNA 16 S-23 S區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用16S rDNA PCR定量快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到蝴蝶蘭軟腐病原，該方法較傳統(tǒng)的PCR靈敏度高100倍；Guglielmo等利用多重 PCR，針對(duì)不同屬立木腐朽菌設(shè)計(jì)特異性引物，共鑒定了11屬的立木腐朽菌。

病原微生物的致病性試驗(yàn)作為柯赫式法則的重要一步分，也經(jīng)歷著不斷發(fā)展。如今，對(duì)寄主植物回接的主要方式有穿刺接種法、打孔接種法、噴霧法接種、離體葉片接種法等。通過(guò)對(duì)寄主植物發(fā)病癥狀和發(fā)病程度的觀察，可以證明病源微生物的致病性。于磊等成功分離出桉樹潰瘍病病原菌并在桉樹幼苗上得以檢驗(yàn)；葉青靜等通過(guò)苗期噴霧法接種和離體葉片接種法對(duì)番茄灰葉斑病原菌進(jìn)行反接實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了病原菌的致病性。

2.細(xì)菌分類研究進(jìn)程

細(xì)菌分類工作主要包括細(xì)菌分離，鑒定，描述，命名，保藏。最小的細(xì)菌長(zhǎng)度僅有0.2nm，由于細(xì)菌個(gè)體過(guò)小，直到17世紀(jì)細(xì)菌才第一次在顯微鏡下露出它本來(lái)面目。至此人們開始對(duì)形態(tài)各異的細(xì)菌進(jìn)行分類，而雙名法的出現(xiàn)使得細(xì)菌的命名得以規(guī)范。在1970年的第十屆國(guó)際微生物學(xué)大會(huì)上發(fā)布的《國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)》，為細(xì)菌命名制定了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)?！斗ㄒ?guī)》認(rèn)為細(xì)菌新名稱需要在國(guó)際系統(tǒng)進(jìn)化微生物學(xué)雜志上發(fā)表方可算是合格的發(fā)表。

第一個(gè)使用雙名法并建立細(xì)菌分類系統(tǒng)的是Ferdinand Cohn。丹麥科學(xué)家orla-jensen和荷蘭科學(xué)家Kluyver在進(jìn)行細(xì)菌分類研究中引入了細(xì)菌生理特征指標(biāo)，接著，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌的生化性狀也具有特異性，如血清反應(yīng)等，于是生化指標(biāo)也成為用于細(xì)菌分類鑒定的工具。生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征共同用于細(xì)菌分類鑒定，使細(xì)菌分類方法得到完善，并極大的推動(dòng)了細(xì)菌分類工作的發(fā)展。由于生理、生化特征指標(biāo)容易受到某些主觀因素的影響，細(xì)菌的分類需要引入其他手段。

因此數(shù)值分類法應(yīng)運(yùn)而生，最早采用此方法的是sneath，將信息技術(shù)引入細(xì)菌鑒定，開發(fā)出新的細(xì)菌分類系統(tǒng)—數(shù)值分類用于細(xì)分類鑒定，如核酸分析，DNADNA雜交，DNA-rRNA雜交等，這些以待測(cè)菌株的遺傳信息為基礎(chǔ)進(jìn)行分類的指標(biāo)使得細(xì)菌分類更為準(zhǔn)確。這些分子手段使得細(xì)菌鑒定的途徑更加豐富，而產(chǎn)生于1986年的基因組學(xué)更是在發(fā)掘新基因，揭示非編碼功能序列及研究物質(zhì)進(jìn)化史等方面發(fā)揮著重要作用。

由于微生物基因組比較小，研究起來(lái)難度也更小一些，所以基因組的研究最早是從微生物開始的。世界上第一個(gè)進(jìn)行全基因組測(cè)序的微生物是流感嗜血桿菌于1995年被測(cè)序，模式生物大腸桿菌)的全基因組序列于1997年被測(cè)定。而在我國(guó)，第一個(gè)由我國(guó)自主測(cè)序得到的全基因組序列是在2002年由北京華大基因研發(fā)中心利用WGS的方法測(cè)序和組裝得到的騰沖嗜熱厭氧菌。這比世界上第一株進(jìn)行全基因組測(cè)序的細(xì)菌要晚七年，但是近年來(lái)隨著我國(guó)在微生物方面投入加大，我國(guó)微生物的科研也得到了快速發(fā)展，越來(lái)越多的微生物進(jìn)行了全基因組測(cè)序.隨著這些微生物完成了全基因組的測(cè)序的工作，這也表明我國(guó)在微生物基因組領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展。

隨著物理技術(shù)研究的深入，氣相色譜，液相色譜也開始應(yīng)用于細(xì)菌分類研究中，一些化學(xué)分析指標(biāo)也被運(yùn)用于細(xì)菌分類鑒定中，如急性脂、呼吸醌、脂肪酸的成分及含量，肽聚糖，胞壁酸和細(xì)胞壁糖成分分析等。這些跨學(xué)科的新方法完善了細(xì)菌分類鑒定技術(shù)，對(duì)于那些使用生理，生化性狀無(wú)法鑒定的物種有了新的研究方法。

到了現(xiàn)代，細(xì)菌分類已經(jīng)進(jìn)入了多相分類的發(fā)展階段，綜合多種方法對(duì)待測(cè)菌株的分類地位進(jìn)行科學(xué)研究，從形態(tài)特點(diǎn)，生理生化性狀再到分子手段，化學(xué)成分分析等多個(gè)層面對(duì)細(xì)菌的各種性狀分析，建立細(xì)菌的多相分類系統(tǒng)，力求合理的展示細(xì)菌之間的親緣關(guān)系。

3.真菌分類研究進(jìn)程

真菌的分類系統(tǒng)依然使用雙名法對(duì)新物種命名。真菌的傳統(tǒng)分類方法主要是以形態(tài)和生理化特征為依據(jù)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、大小、排列、運(yùn)動(dòng)性、特殊構(gòu)造和染色反應(yīng)及菌落形態(tài)以及在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)，來(lái)鑒定該菌株的屬種。形態(tài)特征是細(xì)胞內(nèi)部基因與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，由于受到環(huán)境因子的影響，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果往往是不準(zhǔn)確的。這時(shí)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為真菌分類鑒定開辟了新途徑。通過(guò)対DNA堿基組成的摩爾百分比例的探究，是早期運(yùn)用于真菌進(jìn)行分類鑒定的分子手段。由于該方法只能測(cè)定到綱，所以需要其他方法對(duì)真菌鑒定進(jìn)行補(bǔ)充?，F(xiàn)如今，核糖體脫氧核酸(rDNA)序列測(cè)定、DNA分子雜交技術(shù)、線粒體DNA限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析 ，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)技術(shù)等方法的應(yīng)用，使得真菌分類研究變得操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和可靠。

4.林木病原微生物鑒定及分類方法展望

自從1665 年列文虎克發(fā)明第一個(gè)顯微鏡，使人們來(lái)到了微生物的世界。而1882年柯赫氏法則，讓人類擁有了與植物病害打交道的手段。在長(zhǎng)達(dá)百年的發(fā)展中，尤其是分子技術(shù)的出現(xiàn)，讓林木病原微生物鑒定手段越來(lái)越豐富。如今，全基因組測(cè)序，看家基因分析，多基因序列分析，多重pcr檢測(cè)技術(shù)層出不窮，讓微生物分類在分子層面上有了更多的解釋方法；而隨著電子顯微鏡的出現(xiàn)，也讓很多微觀結(jié)構(gòu)成為微生物形態(tài)學(xué)分類的重要指標(biāo)。隨著工業(yè)科技的不斷提升，微生物的分類界限也將愈加清晰，森林病原微生物的鑒定手段也更加方便快捷。