孫 尚

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西 南昌 330045）

1.國內(nèi)外病原微生物研究進(jìn)展

植物病害會對林業(yè)產(chǎn)生一定的危害，例如造成板栗疫病、歐美楊細(xì)菌潰瘍病、柑橘黃龍病等森林病害，對林業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。植物病害常見的有侵染性病害和非侵染性病害，非侵染性病害由非侵染性病害(環(huán)境)因素引起的病害；侵染性病害是由生物性病原引起的病害，生物性病害病原可分為真菌性、細(xì)菌性、病毒性和螨類等。

傳統(tǒng)分類鑒定方法的相關(guān)研究一般依照柯赫式法則，通常是先取病葉通過組織分離法獲取病原微生物，通過查閱文獻(xiàn)資料進(jìn)行分類鑒定，后通過回接試驗(yàn)引起寄主植物發(fā)病，而后將再分離出的微生物與接種微生物比較。這種方法是植物病理學(xué)上的經(jīng)典，沿用至今。如黃澤余等對廣西紅樹林真菌病害區(qū)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)病原真菌引起的葉部病害是紅樹林的主要病害。費(fèi)顯偉等對李樹細(xì)菌性穿孔病進(jìn)行病原鑒定，發(fā)現(xiàn)病原物為一種革蘭氏陰性細(xì)菌。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的技術(shù)在病原菌鑒定方面表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，為病原鑒定提供了提供了可靠手段。比如，劉鵬等根據(jù)病原菌的核糖體DNA 16 S-23 S區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用16S rDNA PCR定量快速準(zhǔn)確地檢測到蝴蝶蘭軟腐病原，該方法較傳統(tǒng)的PCR靈敏度高100倍；Guglielmo等利用多重 PCR，針對不同屬立木腐朽菌設(shè)計(jì)特異性引物，共鑒定了11屬的立木腐朽菌。

病原微生物的致病性試驗(yàn)作為柯赫式法則的重要一步分，也經(jīng)歷著不斷發(fā)展。如今，對寄主植物回接的主要方式有穿刺接種法、打孔接種法、噴霧法接種、離體葉片接種法等。通過對寄主植物發(fā)病癥狀和發(fā)病程度的觀察，可以證明病源微生物的致病性。于磊等成功分離出桉樹潰瘍病病原菌并在桉樹幼苗上得以檢驗(yàn)；葉青靜等通過苗期噴霧法接種和離體葉片接種法對番茄灰葉斑病原菌進(jìn)行反接實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了病原菌的致病性。

2.細(xì)菌分類研究進(jìn)程

細(xì)菌分類工作主要包括細(xì)菌分離，鑒定，描述，命名，保藏。最小的細(xì)菌長度僅有0.2nm，由于細(xì)菌個(gè)體過小，直到17世紀(jì)細(xì)菌才第一次在顯微鏡下露出它本來面目。至此人們開始對形態(tài)各異的細(xì)菌進(jìn)行分類，而雙名法的出現(xiàn)使得細(xì)菌的命名得以規(guī)范。在1970年的第十屆國際微生物學(xué)大會上發(fā)布的《國際細(xì)菌命名法規(guī)》，為細(xì)菌命名制定了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)?！斗ㄒ?guī)》認(rèn)為細(xì)菌新名稱需要在國際系統(tǒng)進(jìn)化微生物學(xué)雜志上發(fā)表方可算是合格的發(fā)表。

第一個(gè)使用雙名法并建立細(xì)菌分類系統(tǒng)的是Ferdinand Cohn。丹麥科學(xué)家orla-jensen和荷蘭科學(xué)家Kluyver在進(jìn)行細(xì)菌分類研究中引入了細(xì)菌生理特征指標(biāo)，接著，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌的生化性狀也具有特異性，如血清反應(yīng)等，于是生化指標(biāo)也成為用于細(xì)菌分類鑒定的工具。生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征共同用于細(xì)菌分類鑒定，使細(xì)菌分類方法得到完善，并極大的推動了細(xì)菌分類工作的發(fā)展。由于生理、生化特征指標(biāo)容易受到某些主觀因素的影響，細(xì)菌的分類需要引入其他手段。

因此數(shù)值分類法應(yīng)運(yùn)而生，最早采用此方法的是sneath，將信息技術(shù)引入細(xì)菌鑒定，開發(fā)出新的細(xì)菌分類系統(tǒng)—數(shù)值分類用于細(xì)分類鑒定，如核酸分析，DNADNA雜交，DNA-rRNA雜交等，這些以待測菌株的遺傳信息為基礎(chǔ)進(jìn)行分類的指標(biāo)使得細(xì)菌分類更為準(zhǔn)確。這些分子手段使得細(xì)菌鑒定的途徑更加豐富，而產(chǎn)生于1986年的基因組學(xué)更是在發(fā)掘新基因，揭示非編碼功能序列及研究物質(zhì)進(jìn)化史等方面發(fā)揮著重要作用。

由于微生物基因組比較小，研究起來難度也更小一些，所以基因組的研究最早是從微生物開始的。世界上第一個(gè)進(jìn)行全基因組測序的微生物是流感嗜血桿菌于1995年被測序，模式生物大腸桿菌)的全基因組序列于1997年被測定。而在我國，第一個(gè)由我國自主測序得到的全基因組序列是在2002年由北京華大基因研發(fā)中心利用WGS的方法測序和組裝得到的騰沖嗜熱厭氧菌。這比世界上第一株進(jìn)行全基因組測序的細(xì)菌要晚七年，但是近年來隨著我國在微生物方面投入加大，我國微生物的科研也得到了快速發(fā)展，越來越多的微生物進(jìn)行了全基因組測序.隨著這些微生物完成了全基因組的測序的工作，這也表明我國在微生物基因組領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展。

隨著物理技術(shù)研究的深入，氣相色譜，液相色譜也開始應(yīng)用于細(xì)菌分類研究中，一些化學(xué)分析指標(biāo)也被運(yùn)用于細(xì)菌分類鑒定中，如急性脂、呼吸醌、脂肪酸的成分及含量，肽聚糖，胞壁酸和細(xì)胞壁糖成分分析等。這些跨學(xué)科的新方法完善了細(xì)菌分類鑒定技術(shù)，對于那些使用生理，生化性狀無法鑒定的物種有了新的研究方法。

到了現(xiàn)代，細(xì)菌分類已經(jīng)進(jìn)入了多相分類的發(fā)展階段，綜合多種方法對待測菌株的分類地位進(jìn)行科學(xué)研究，從形態(tài)特點(diǎn)，生理生化性狀再到分子手段，化學(xué)成分分析等多個(gè)層面對細(xì)菌的各種性狀分析，建立細(xì)菌的多相分類系統(tǒng)，力求合理的展示細(xì)菌之間的親緣關(guān)系。

3.真菌分類研究進(jìn)程

真菌的分類系統(tǒng)依然使用雙名法對新物種命名。真菌的傳統(tǒng)分類方法主要是以形態(tài)和生理化特征為依據(jù)，通過對細(xì)胞形態(tài)、大小、排列、運(yùn)動性、特殊構(gòu)造和染色反應(yīng)及菌落形態(tài)以及在培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)，來鑒定該菌株的屬種。形態(tài)特征是細(xì)胞內(nèi)部基因與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，由于受到環(huán)境因子的影響，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果往往是不準(zhǔn)確的。這時(shí)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為真菌分類鑒定開辟了新途徑。通過対DNA堿基組成的摩爾百分比例的探究，是早期運(yùn)用于真菌進(jìn)行分類鑒定的分子手段。由于該方法只能測定到綱，所以需要其他方法對真菌鑒定進(jìn)行補(bǔ)充。現(xiàn)如今，核糖體脫氧核酸(rDNA)序列測定、DNA分子雜交技術(shù)、線粒體DNA限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析 ，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)技術(shù)等方法的應(yīng)用，使得真菌分類研究變得操作簡便、準(zhǔn)確和可靠。

4.林木病原微生物鑒定及分類方法展望

自從1665 年列文虎克發(fā)明第一個(gè)顯微鏡，使人們來到了微生物的世界。而1882年柯赫氏法則，讓人類擁有了與植物病害打交道的手段。在長達(dá)百年的發(fā)展中，尤其是分子技術(shù)的出現(xiàn)，讓林木病原微生物鑒定手段越來越豐富。如今，全基因組測序，看家基因分析，多基因序列分析，多重pcr檢測技術(shù)層出不窮，讓微生物分類在分子層面上有了更多的解釋方法；而隨著電子顯微鏡的出現(xiàn)，也讓很多微觀結(jié)構(gòu)成為微生物形態(tài)學(xué)分類的重要指標(biāo)。隨著工業(yè)科技的不斷提升，微生物的分類界限也將愈加清晰，森林病原微生物的鑒定手段也更加方便快捷。