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        林木病原微生物鑒定及分類(lèi)方法進(jìn)展探究

        2021-12-24 05:05:45
        關(guān)鍵詞:病原基因組真菌

        孫 尚

        (江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,江西 南昌 330045)

        1.國(guó)內(nèi)外病原微生物研究進(jìn)展

        植物病害會(huì)對(duì)林業(yè)產(chǎn)生一定的危害,例如造成板栗疫病、歐美楊細(xì)菌潰瘍病、柑橘黃龍病等森林病害,對(duì)林業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。植物病害常見(jiàn)的有侵染性病害和非侵染性病害,非侵染性病害由非侵染性病害(環(huán)境)因素引起的病害;侵染性病害是由生物性病原引起的病害,生物性病害病原可分為真菌性、細(xì)菌性、病毒性和螨類(lèi)等。

        傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定方法的相關(guān)研究一般依照柯赫式法則,通常是先取病葉通過(guò)組織分離法獲取病原微生物,通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料進(jìn)行分類(lèi)鑒定,后通過(guò)回接試驗(yàn)引起寄主植物發(fā)病,而后將再分離出的微生物與接種微生物比較。這種方法是植物病理學(xué)上的經(jīng)典,沿用至今。如黃澤余等對(duì)廣西紅樹(shù)林真菌病害區(qū)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)病原真菌引起的葉部病害是紅樹(shù)林的主要病害。費(fèi)顯偉等對(duì)李樹(shù)細(xì)菌性穿孔病進(jìn)行病原鑒定,發(fā)現(xiàn)病原物為一種革蘭氏陰性細(xì)菌。

        隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,新的技術(shù)在病原菌鑒定方面表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù),制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用,為病原鑒定提供了提供了可靠手段。比如,劉鵬等根據(jù)病原菌的核糖體DNA 16 S-23 S區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物,應(yīng)用16S rDNA PCR定量快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到蝴蝶蘭軟腐病原,該方法較傳統(tǒng)的PCR靈敏度高100倍;Guglielmo等利用多重 PCR,針對(duì)不同屬立木腐朽菌設(shè)計(jì)特異性引物,共鑒定了11屬的立木腐朽菌。

        病原微生物的致病性試驗(yàn)作為柯赫式法則的重要一步分,也經(jīng)歷著不斷發(fā)展。如今,對(duì)寄主植物回接的主要方式有穿刺接種法、打孔接種法、噴霧法接種、離體葉片接種法等。通過(guò)對(duì)寄主植物發(fā)病癥狀和發(fā)病程度的觀察,可以證明病源微生物的致病性。于磊等成功分離出桉樹(shù)潰瘍病病原菌并在桉樹(shù)幼苗上得以檢驗(yàn);葉青靜等通過(guò)苗期噴霧法接種和離體葉片接種法對(duì)番茄灰葉斑病原菌進(jìn)行反接實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了病原菌的致病性。

        2.細(xì)菌分類(lèi)研究進(jìn)程

        細(xì)菌分類(lèi)工作主要包括細(xì)菌分離,鑒定,描述,命名,保藏。最小的細(xì)菌長(zhǎng)度僅有0.2nm,由于細(xì)菌個(gè)體過(guò)小,直到17世紀(jì)細(xì)菌才第一次在顯微鏡下露出它本來(lái)面目。至此人們開(kāi)始對(duì)形態(tài)各異的細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi),而雙名法的出現(xiàn)使得細(xì)菌的命名得以規(guī)范。在1970年的第十屆國(guó)際微生物學(xué)大會(huì)上發(fā)布的《國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)》,為細(xì)菌命名制定了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)?!斗ㄒ?guī)》認(rèn)為細(xì)菌新名稱(chēng)需要在國(guó)際系統(tǒng)進(jìn)化微生物學(xué)雜志上發(fā)表方可算是合格的發(fā)表。

        第一個(gè)使用雙名法并建立細(xì)菌分類(lèi)系統(tǒng)的是Ferdinand Cohn。丹麥科學(xué)家orla-jensen和荷蘭科學(xué)家Kluyver在進(jìn)行細(xì)菌分類(lèi)研究中引入了細(xì)菌生理特征指標(biāo),接著,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌的生化性狀也具有特異性,如血清反應(yīng)等,于是生化指標(biāo)也成為用于細(xì)菌分類(lèi)鑒定的工具。生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征共同用于細(xì)菌分類(lèi)鑒定,使細(xì)菌分類(lèi)方法得到完善,并極大的推動(dòng)了細(xì)菌分類(lèi)工作的發(fā)展。由于生理、生化特征指標(biāo)容易受到某些主觀因素的影響,細(xì)菌的分類(lèi)需要引入其他手段。

        因此數(shù)值分類(lèi)法應(yīng)運(yùn)而生,最早采用此方法的是sneath,將信息技術(shù)引入細(xì)菌鑒定,開(kāi)發(fā)出新的細(xì)菌分類(lèi)系統(tǒng)—數(shù)值分類(lèi)用于細(xì)分類(lèi)鑒定,如核酸分析,DNADNA雜交,DNA-rRNA雜交等,這些以待測(cè)菌株的遺傳信息為基礎(chǔ)進(jìn)行分類(lèi)的指標(biāo)使得細(xì)菌分類(lèi)更為準(zhǔn)確。這些分子手段使得細(xì)菌鑒定的途徑更加豐富,而產(chǎn)生于1986年的基因組學(xué)更是在發(fā)掘新基因,揭示非編碼功能序列及研究物質(zhì)進(jìn)化史等方面發(fā)揮著重要作用。

        由于微生物基因組比較小,研究起來(lái)難度也更小一些,所以基因組的研究最早是從微生物開(kāi)始的。世界上第一個(gè)進(jìn)行全基因組測(cè)序的微生物是流感嗜血桿菌于1995年被測(cè)序,模式生物大腸桿菌)的全基因組序列于1997年被測(cè)定。而在我國(guó),第一個(gè)由我國(guó)自主測(cè)序得到的全基因組序列是在2002年由北京華大基因研發(fā)中心利用WGS的方法測(cè)序和組裝得到的騰沖嗜熱厭氧菌。這比世界上第一株進(jìn)行全基因組測(cè)序的細(xì)菌要晚七年,但是近年來(lái)隨著我國(guó)在微生物方面投入加大,我國(guó)微生物的科研也得到了快速發(fā)展,越來(lái)越多的微生物進(jìn)行了全基因組測(cè)序.隨著這些微生物完成了全基因組的測(cè)序的工作,這也表明我國(guó)在微生物基因組領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展。

        隨著物理技術(shù)研究的深入,氣相色譜,液相色譜也開(kāi)始應(yīng)用于細(xì)菌分類(lèi)研究中,一些化學(xué)分析指標(biāo)也被運(yùn)用于細(xì)菌分類(lèi)鑒定中,如急性脂、呼吸醌、脂肪酸的成分及含量,肽聚糖,胞壁酸和細(xì)胞壁糖成分分析等。這些跨學(xué)科的新方法完善了細(xì)菌分類(lèi)鑒定技術(shù),對(duì)于那些使用生理,生化性狀無(wú)法鑒定的物種有了新的研究方法。

        到了現(xiàn)代,細(xì)菌分類(lèi)已經(jīng)進(jìn)入了多相分類(lèi)的發(fā)展階段,綜合多種方法對(duì)待測(cè)菌株的分類(lèi)地位進(jìn)行科學(xué)研究,從形態(tài)特點(diǎn),生理生化性狀再到分子手段,化學(xué)成分分析等多個(gè)層面對(duì)細(xì)菌的各種性狀分析,建立細(xì)菌的多相分類(lèi)系統(tǒng),力求合理的展示細(xì)菌之間的親緣關(guān)系。

        3.真菌分類(lèi)研究進(jìn)程

        真菌的分類(lèi)系統(tǒng)依然使用雙名法對(duì)新物種命名。真菌的傳統(tǒng)分類(lèi)方法主要是以形態(tài)和生理化特征為依據(jù),通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、大小、排列、運(yùn)動(dòng)性、特殊構(gòu)造和染色反應(yīng)及菌落形態(tài)以及在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài),來(lái)鑒定該菌株的屬種。形態(tài)特征是細(xì)胞內(nèi)部基因與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,由于受到環(huán)境因子的影響,形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果往往是不準(zhǔn)確的。這時(shí)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,為真菌分類(lèi)鑒定開(kāi)辟了新途徑。通過(guò)対DNA堿基組成的摩爾百分比例的探究,是早期運(yùn)用于真菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定的分子手段。由于該方法只能測(cè)定到綱,所以需要其他方法對(duì)真菌鑒定進(jìn)行補(bǔ)充?,F(xiàn)如今,核糖體脫氧核酸(rDNA)序列測(cè)定、DNA分子雜交技術(shù)、線粒體DNA限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析 ,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)技術(shù)等方法的應(yīng)用,使得真菌分類(lèi)研究變得操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和可靠。

        4.林木病原微生物鑒定及分類(lèi)方法展望

        自從1665 年列文虎克發(fā)明第一個(gè)顯微鏡,使人們來(lái)到了微生物的世界。而1882年柯赫氏法則,讓人類(lèi)擁有了與植物病害打交道的手段。在長(zhǎng)達(dá)百年的發(fā)展中,尤其是分子技術(shù)的出現(xiàn),讓林木病原微生物鑒定手段越來(lái)越豐富。如今,全基因組測(cè)序,看家基因分析,多基因序列分析,多重pcr檢測(cè)技術(shù)層出不窮,讓微生物分類(lèi)在分子層面上有了更多的解釋方法;而隨著電子顯微鏡的出現(xiàn),也讓很多微觀結(jié)構(gòu)成為微生物形態(tài)學(xué)分類(lèi)的重要指標(biāo)。隨著工業(yè)科技的不斷提升,微生物的分類(lèi)界限也將愈加清晰,森林病原微生物的鑒定手段也更加方便快捷。

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