袁蒙蒙，許懷禮，徐頂巧，唐志書，劉乃堯，許洪波*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽712083；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

沙苑子(Astragali complanati semen)為豆科植物扁莖黃芪AstragaluscomplanatusR.Br.的干燥成熟種子[1]，具有補(bǔ)腎壯陽、固精縮尿、養(yǎng)肝明目的功效，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其藥用歷史悠久[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，沙苑子具有養(yǎng)肝明目[3-4]、增強(qiáng)免疫[5]、補(bǔ)腎縮尿[6]、抗癌[7]等功效，可用于治療肝腎虧虛[8]、白濁帶下、頭暈?zāi)垦?，也可利尿澀精[9]、抗氧化[10-11]。沙苑子中主要包含黃酮、皂苷及多糖成分。其中沙苑子總黃酮具有降壓降脂[12-13]、保肝[14-15]、抗氧化[16]及抗癌[17-18]等藥理作用。沙苑子為臨床常用藥材，毒性極低，其毒性在100 g/kg以上，是具有廣泛藥效且無毒的安全藥物[19]。

臨床處方調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鹽沙苑子使用居多，沙苑子藥性甘、溫，歸肝腎經(jīng)，鹽制可引其入腎，能更好地發(fā)揮補(bǔ)腎縮尿的作用。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑被用來保障臨床治療時(shí)的用藥準(zhǔn)確性及劑量一致性，使得臨床治療時(shí)的用藥更加規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)[20]。本研究依照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的方法，選用3個(gè)產(chǎn)區(qū)15批沙苑子飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以沙苑子苷為指標(biāo)成分，從指標(biāo)成分定量和整體定性方面評(píng)價(jià)鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20XR型高效液相色譜儀和LC-20型在線超高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FTS-10A型多功能煎藥鍋(潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司)；CPA2250型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精密度0.01 mg)；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)。

1.2 試藥

沙苑子苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111803-201704，含量：99.1%)；鹽沙苑子對(duì)照藥材均從正規(guī)檢查合格的藥廠購進(jìn)，藥材信息見表1；乙腈(色譜純，霍尼韋爾公司)；純化水；其余試劑均為分析純。

表1 鹽沙苑子藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽沙苑子飲片檢查

按照《中國藥典》2020版鹽沙苑子飲片的檢查規(guī)定，測(cè)得15批鹽沙苑子含水量為6.72%～9.91%，灰分量為1.20%～4.94%，酸不溶灰分為0.01%～0.04%，結(jié)果見表2。以上檢查均符合2020版《中國藥典》規(guī)定，飲片符合標(biāo)準(zhǔn)。

表2 15批鹽沙苑子的質(zhì)量檢查

2.2 鹽沙苑子飲片中沙苑子苷的含量測(cè)定

按照2020年版《中國藥典》沙苑子含量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，沙苑子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%～0.18%。結(jié)果表明，15批沙苑子飲片均符合《中國藥典》對(duì)沙苑子的含量測(cè)定要求(含沙苑子苷不得少于0.10%)。

2.3 鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取干燥鹽沙苑子飲片100 g，以沒過飲片的水量浸泡30 min后，用8倍量的水，煎煮30 min，趁熱用7號(hào)藥典篩過濾，保留濾液，再加6倍量的水，繼續(xù)煎煮30 min，同上方法過濾，合并濾液，濃縮至500 mL濃縮液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中沙苑子苷的含量測(cè)定

2.4.1 HPLC色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(21∶79)，等度洗脫30 min，波長：266 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：5 μL，色譜見圖1。

A：對(duì)照品；B：鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖1 鹽沙苑子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC譜圖

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.3”項(xiàng)下的鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑于10 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，過0.45 μm濾膜，即得。

2.4.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱量9.98 mg沙苑子苷對(duì)照品，加60%乙醇定容至25 mL容量瓶中，即得濃度為399.2 μg/mL的沙苑子苷儲(chǔ)備液。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取“2.4.3”項(xiàng)下沙苑子苷對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣0.1、0.2、0.5、1、2、3 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。沙苑子苷線性方程為Y=2 472 045.66X-9 655.01，R2=0.999，線性范圍0.0 399～1.197 6 mg/mL。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液(S4)按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣6次，相對(duì)峰面積RSD=0.20%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S4)放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，24 h內(nèi)相對(duì)峰面積RSD=0.11%，表明此樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液(S4)，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，相對(duì)峰面積RSD=0.71%，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知沙苑子苷含量的供試品溶液(S4)6份，加入沙苑子苷對(duì)照品適量，混勻按照供試品制備方法制備，記錄峰面積，計(jì)算其平均回收率為102.8%，RSD=0.93%，表明該方法可用于沙苑子苷的含量測(cè)定。

2.4.9 樣品測(cè)定 按“2.4.1”項(xiàng)下條件對(duì)15批鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行含量測(cè)定，記錄沙苑子苷的峰面積，計(jì)算沙苑子苷含量。

2.5 過程穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)參數(shù)的設(shè)定

通過“2.3”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，出膏率量取標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL，干燥，稱定浸膏質(zhì)量，計(jì)算出膏率，見表3。結(jié)果表明，15批樣品的出膏率范圍為10.52%～17.70%，平均值為15.47%。

轉(zhuǎn)移率=m/M×100%，其中，m表示16 g藥材按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑方法提取的沙苑子苷的量(mg)，M表示1 g藥材按照藥典方法提取出的沙苑子苷的量(mg)，結(jié)果見表3，轉(zhuǎn)移率范圍為42.94%～81.22%，平均值為60.10%。

表3 鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定

2.6 UPLC指紋圖譜分析

2.6.1 UPLC色譜條件 Thermo Fisher Scientific Accucore C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)流動(dòng)相為0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)；柱溫為30 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

A：對(duì)照品；B：鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑。圖2 鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取供試樣品(S2)按“2.6.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣6次，用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算色譜圖的相似度。相對(duì)峰面積RSD=0.81%，相似度均大于0.9，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S2)按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，相對(duì)峰面積RSD=0.10%，相似度均大于0.9，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S2)放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.6.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，相對(duì)峰面積RSD=1.71%，相似度均大于0.9，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 UPLC指紋圖譜采集 按“2.6.1”項(xiàng)下方法，采集15批鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC指紋圖譜，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A)”進(jìn)行色譜峰匹配，計(jì)算相似度，結(jié)果表明，15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照譜圖的相似度均大于0.98，符合中藥指紋圖譜要求。

圖3 15批鹽沙苑子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

2.7 質(zhì)譜指認(rèn)

2.7.1 質(zhì)譜條件 采用SCIEX Triple TOFTM5600+質(zhì)譜儀，DuoSprayTM離子源，離子化模式為正、負(fù)離子，離子源溫度500 ℃，脫溶劑氣體為高純度氮?dú)猓瑨呙璺秶鷐/z為100～2 000。

2.7.2 色譜峰的指認(rèn) 取供試品溶液5 μL注入SCIEX Triple TOFTM5600+/MS系統(tǒng)，按“2.6.1”項(xiàng)下條件運(yùn)行，記錄數(shù)據(jù)，采用Analyst TF 1.7.1軟件對(duì)總離子流圖進(jìn)行處理和分析，比對(duì)精確相對(duì)分子質(zhì)量，保留時(shí)間，特征碎片峰，已建立的數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)[21-23]，推測(cè)共有峰的化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果見表5，質(zhì)譜總離子流見圖4，化合物結(jié)構(gòu)見圖5。

表4 15批鹽沙苑子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度

A：正離子模式；B：負(fù)離子模式圖4 沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)譜總離子流

圖5 鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中指認(rèn)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表5 正、負(fù)離子模式下鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有指紋峰的鑒定

3 討論

沙苑子中含有黃酮、三萜皂苷類化合物，黃酮類化合物是其主要的有效成分，沙苑子苷是主要的生物活性成分之一，具有保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化的作用[24]，故本試驗(yàn)選取沙苑子苷為指標(biāo)性成分，結(jié)果表明，不同批次和不同產(chǎn)地的沙苑子苷含量均符合要求，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中沙苑子苷轉(zhuǎn)移率為42.94%～81.22%，平均值為60.10%，在266 nm下的質(zhì)譜結(jié)果顯示，13個(gè)成分中以黃酮和皂苷為主，表明該波長下的圖譜科學(xué)可靠，能反映沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要成分。

本研究篩選了沙苑子3個(gè)主產(chǎn)地(陜西、河北、四川)的樣品，每個(gè)產(chǎn)地各5批，樣品具有代表性。試驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制主要體現(xiàn)在：①藥材選擇均來自沙苑子的主產(chǎn)區(qū)，實(shí)驗(yàn)前對(duì)藥材進(jìn)行了檢測(cè)，符合藥典規(guī)定；②制備工藝符合相關(guān)技術(shù)要求中標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的方法；③采用指紋圖譜和沙苑子苷含量測(cè)定相結(jié)合的方式評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量，并結(jié)合質(zhì)譜指認(rèn)，推斷其共有峰，從化學(xué)輪廓和指標(biāo)成分定量標(biāo)定了鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征，為鹽沙苑子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備和質(zhì)量控制提供參考。