鄢 偉，王靜靜，李曉東

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血的重要原因，具有較高的致殘率和病死率[1-2]。因此，研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病理生理機(jī)制，對(duì)預(yù)防顱內(nèi)動(dòng)脈瘤具有重要意義。相關(guān)研究顯示，血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3]。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。microRNA(miRNA)是非編碼小分子RNA，可調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。miR-126基因位于9q34.3，可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[5]。另外，血管平滑肌細(xì)胞異?？梢鹧鼙谥厮?，導(dǎo)致動(dòng)脈瘤發(fā)生[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b能調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，與動(dòng)脈瘤發(fā)生相關(guān)[7]。也有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，miR-126、miR-125b可通過(guò)調(diào)控VEGF及MMP-9參與疾病的發(fā)生[8]。但二者在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者外周血中的表達(dá)及與臨床特征、預(yù)后、VEGF、MMP-9關(guān)系的報(bào)道較少，因此本研究對(duì)此進(jìn)行分析，旨在為臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年8月—2020年8月于我院行手術(shù)治療的104例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的臨床資料，并設(shè)為觀察組，其中男60例，女44例；年齡35～80(42.16±5.77)歲。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并經(jīng)腦血管造影確診；年齡30～80歲；既往無(wú)手術(shù)或藥物治療史，且顱內(nèi)動(dòng)脈瘤未破裂；臨床資料完整。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；合并惡性腫瘤者；有嚴(yán)重頭部外傷史；臨床資料不完整。對(duì)觀察組進(jìn)行6個(gè)月的隨訪，根據(jù)不同預(yù)后分為生存組86例和死亡組18例。另選取同期進(jìn)行體檢的健康者100例作為對(duì)照組，其中男62例，女38例；年齡35～75(41.98±5.70)歲。觀察組和對(duì)照組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2方法

1.2.1治療方法：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者均行顯微鏡外科手術(shù)治療，取平臥位，暴露穿刺部位，取單側(cè)翼點(diǎn)入路，顯微鏡下解剖外側(cè)裂池，導(dǎo)出腦脊液，顯露載瘤動(dòng)脈，細(xì)心解剖瘤頸，采用動(dòng)脈瘤夾夾閉動(dòng)脈血管；可臨時(shí)阻斷處理載瘤動(dòng)脈，0.9%氯化鈉注射液沖洗腦池，罌粟堿明膠海綿包裹載瘤動(dòng)脈。手術(shù)完成后及時(shí)中和肝素，給予10 mg/100 ml尼莫地平注射液2～3 ml/h持續(xù)靜脈泵入24 h，連續(xù)用藥2周。同時(shí)采用我院自行設(shè)計(jì)的調(diào)查表收集患者一般資料。

1.2.2血清miR-126、miR-125b表達(dá)測(cè)定：觀察組入院后第1天和術(shù)后第7天采集晨起空腹靜脈血5 ml，對(duì)照組采集體檢日晨起空腹靜脈血5 ml，均以4000 r/min離心10 min，留取上清-80 ℃冰箱保存。取200 μl樣品，應(yīng)用Trizol法提取血清中總RNA，用異丙醇沉淀總RNA后75%乙醇洗滌，8000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，50 μl的DEPC水溶解，NaroDrop檢測(cè)RNA溶液的濃度及純度，OD260/OD280為1.8～2.1。以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 16 min，84 ℃ 6 s。qRT-PCR總反應(yīng)體系20 μl，模板cDNA 1 μl，Taq聚合酶0.2 μl、正向及反向引物各1 μl、2×SYBRGreenmix 1 μl及20 mmol/L的dNTPs 1 μl，無(wú)RNA酶水14.8 μl。反應(yīng)條件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，70 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-126引物正向：5'-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3'，反向：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT-3'；miR-125b引物正向：5'-GCCGTAAAGTGCTGACAGT-3'，反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；內(nèi)參基因U6引物正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。結(jié)果采用相對(duì)定量法表示，目的基因miR-126、miR-125b的表達(dá)分別采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3血清MMP-9、VEGF水平測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清MMP-9、VEGF水平，試劑盒由北京博爾邁生物技術(shù)有限公司提供，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3觀察指標(biāo) ①記錄觀察組手術(shù)前后及對(duì)照組血清miR-126、miR-125b表達(dá)及VEGF、MMP-9水平；②觀察術(shù)前血清miR-126、miR-125b表達(dá)與臨床特征的關(guān)系；③記錄生存組和死亡組術(shù)后血清miR-126、miR-125b表達(dá)水平；④分析術(shù)前血清miR-126、miR-125b與VEGF、MMP-9的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1血清miR-126、miR-125b表達(dá)比較 觀察組術(shù)前和術(shù)后血清miR-126表達(dá)均高于對(duì)照組，miR-125b表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組術(shù)后血清miR-126表達(dá)低于術(shù)前，miR-125b表達(dá)高于術(shù)前(P<0.05)。見表1。

表1 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者和健康者兩組血清miR-126、miR-125b表達(dá)比較

2.2血清VEGF、MMP-9水平比較 觀察組術(shù)前和術(shù)后血清VEGF、MMP-9水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組術(shù)后血清VEGF、MMP-9水平低于術(shù)前(P<0.05)。見表2。

表2 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者和健康者兩組血清VEGF、MMP-9水平比較

2.3術(shù)前血清miR-126、miR-125b表達(dá)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者臨床特征關(guān)系 術(shù)前血清miR-126、miR-125b表達(dá)與年齡、性別、動(dòng)脈瘤形態(tài)、動(dòng)脈瘤位置無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，而與動(dòng)脈瘤數(shù)目、動(dòng)脈瘤直徑有關(guān)(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 術(shù)前血清miR-126、miR-125b表達(dá)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者臨床特征關(guān)系

2.4不同預(yù)后顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者術(shù)后血清miR-126、miR-125b表達(dá)比較 生存組術(shù)后血清miR-126表達(dá)低于死亡組，miR-125b表達(dá)高于死亡組(P<0.01)。見表4。

表4 不同預(yù)后顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者術(shù)后血清miR-126、miR-125b表達(dá)比較

2.5術(shù)前血清miR-126、miR-125b表達(dá)與VEGF、MMP-9的相關(guān)性 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者術(shù)前血清miR-126表達(dá)與VEGF、MMP-9呈正相關(guān)(r=0.381、0.369，P均<0.001)，miR-125b表達(dá)與VEGF、MMP-9呈負(fù)相關(guān)(r=-0.364、-0.405，P均<0.001)。見圖1。

3 討論

miRNA可調(diào)控人體的生長(zhǎng)發(fā)育，且由于其表達(dá)穩(wěn)定，已成為重要的生物學(xué)標(biāo)志物[10]。研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者存在異常miRNA表達(dá)譜，且生物學(xué)信息表明，miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等方式參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制[11]。miR-126可調(diào)控血管細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，并影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與血管生成和重塑[12]。本研究結(jié)果顯示，觀察組術(shù)前血清miR-126表達(dá)高于對(duì)照組，表明miR-126可能參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展，原因?yàn)轱B內(nèi)動(dòng)脈瘤可促進(jìn)血管生成，進(jìn)而使miR-126高表達(dá)。miR-125是高度保守的miRNA家族，其異常表達(dá)與炎癥、免疫等密切相關(guān)[13]。研究表明，miR-125b在腹主動(dòng)脈瘤中表達(dá)下調(diào)[14]。本研究結(jié)果顯示，觀察組術(shù)前血清miR-125b表達(dá)低于對(duì)照組，考慮與長(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)miR-125b的抑制作用有關(guān)。另外，觀察組術(shù)后血清miR-126表達(dá)低于術(shù)前，miR-125b表達(dá)高于術(shù)前，提示手術(shù)治療可改善患者血清miR-126、miR-125b表達(dá)。同時(shí)本研究顯示，觀察組血清miR-126、miR-125b表達(dá)與動(dòng)脈瘤數(shù)目、動(dòng)脈瘤直徑有關(guān)，其原因可能是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤使miR-125b表達(dá)降低，導(dǎo)致MMP-9水平升高，MMP-9降低顱內(nèi)動(dòng)脈血管彈性，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈瘤數(shù)目、直徑增大；miR-126可促進(jìn)VEGF生成，從而降低動(dòng)脈血管彈性，導(dǎo)致動(dòng)脈瘤數(shù)目和直徑增大。本研究還發(fā)現(xiàn)，生存組術(shù)后血清miR-126表達(dá)低于死亡組，miR-125b表達(dá)高于死亡組，提示術(shù)后血清miR-126、miR-125b表達(dá)可為預(yù)后評(píng)估提供參考。

目前，有學(xué)者認(rèn)為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是由動(dòng)脈血管壁缺陷和顱內(nèi)壓增高引起的[15]。GUO等[16]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF、MMP-9參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生。MMP-9高表達(dá)會(huì)加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致血管外膜纖維連接薄弱，加速動(dòng)脈瘤形成。VEGF可促進(jìn)MMP-9激活，并引起尿激酶型纖溶酶表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮促細(xì)胞外基質(zhì)降解作用[17-18]。本研究顯示，觀察組術(shù)前血清VEGF、MMP-9水平高于對(duì)照組，提示VEGF、MMP-9可能參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生；觀察組術(shù)后血清VEGF、MMP-9水平低于術(shù)前，提示手術(shù)可改善患者血清VEGF、MMP-9水平。另外，Spearman相關(guān)分析顯示，術(shù)前血清miR-126表達(dá)與VEGF、MMP-9呈正相關(guān)，miR-125b表達(dá)與VEGF、MMP-9呈負(fù)相關(guān)，提示血清miR-126表達(dá)升高和miR-125b表達(dá)降低均可升高VEGF、MMP-9。但本研究納入樣本量少且隨訪時(shí)間較短，可能影響結(jié)論，下一步將擴(kuò)大樣本量并延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，以期更好地為臨床提供參考。

綜上所述，血清miR-126、miR-125b在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中存在異常表達(dá)，且與動(dòng)脈瘤數(shù)目、直徑、預(yù)后及VEGF、MMP-9水平具有密切關(guān)聯(lián)。