張 丹，李國祝，王春蕾

系統(tǒng)性紅斑狼瘡為自身免疫性疾病，好發(fā)于生育期女性，常伴腎臟免疫復(fù)合物沉積[1]。腎小球系膜細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，受免疫復(fù)合物沉積的影響，可激活并釋放炎性因子，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤，引起并放大炎癥反應(yīng)，加重腎臟損傷[2]。狼瘡性腎炎(LN)作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，可進(jìn)展為終末期腎臟病，及時(shí)、準(zhǔn)確治療對(duì)患者預(yù)后具有重要意義[3]。microRNA(miRNA)是一種高度保守的內(nèi)源性小RNA，可調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程。近年有學(xué)者指出，miRNA在LN發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位[4]。核受體亞家族4A組成員1(NR4A1)是一種早期基因產(chǎn)物，廣泛參與生物的生長、代謝及炎癥調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1可能參與LN的發(fā)生發(fā)展[5]?；诖耍狙芯窟x取126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡為研究對(duì)象，評(píng)估患者腎組織miR-7977、NR4A1的表達(dá)水平及與LN病理分型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月—2019年4月我院收治的126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡為研究對(duì)象。根據(jù)腎穿刺活組織病理檢查結(jié)果將系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者分為LN組與非LN組。根據(jù)國際腎臟病學(xué)會(huì)/腎臟病理學(xué)會(huì)工作組制定的病理分型標(biāo)準(zhǔn)[6]，評(píng)估LN患者的病理分型，分為輕微病變型LN(Ⅰ型)、系膜增生性LN(Ⅱ型)、局灶性LN(Ⅲ型)、彌漫性LN(Ⅳ型)、膜性LN(Ⅴ型)、硬化性LN(Ⅵ型)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；均行經(jīng)皮腎穿刺活組織病理檢查；患者及家屬均簽署知情同意書；經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性腎臟病或其他繼發(fā)性腎臟病；近3個(gè)月行外科手術(shù)或有外傷史；合并內(nèi)分泌系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾??；伴惡性腫瘤；合并腦血管意外或狼瘡性腦病；慢性傳染病或活動(dòng)性感染性疾??；妊娠、哺乳或更年期婦女。

1.3方法

1.3.1miR-7977表達(dá)檢測：126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡進(jìn)行經(jīng)皮腎穿刺活組織病理檢查，取腎組織冷凍研磨后，使用miRNA提取試劑盒(德國QIAGEN)提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(德國QIAGEN)，以U6作為內(nèi)參，檢測miR-7977表達(dá)情況，按照2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[8]。

1.3.2NR4A1表達(dá)檢測：取腎組織石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片后脫蠟水化，經(jīng)3%過氧化氫孵育、PBS沖洗、微波法抗原熱修復(fù)，然后滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育；分別滴加一抗工作液(上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后PBS沖洗，滴加二抗工作液(羊抗兔，南京生興生物技術(shù)有限公司)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后滴加適量DAB；蘇木素復(fù)染5 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡檢。免疫組織化學(xué)評(píng)分方法：①根據(jù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(25%～50%)、3分(50%～75%)、4分(≥75%)；②根據(jù)陽性細(xì)胞著色程度評(píng)分，0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，各視野上述2項(xiàng)評(píng)分相加，計(jì)算5個(gè)視野平均分，即為NR4A1表達(dá)評(píng)分。

1.4觀察指標(biāo) 比較兩組腎組織miR-7977表達(dá)量及NR4A1表達(dá)評(píng)分差異，評(píng)估m(xù)iR-7977表達(dá)量和NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN的診斷價(jià)值，分析miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與LN患者病理分型的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1基線資料比較 126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，確診LN 58例(46.03%)，未發(fā)生LN 68例(53.97%)。兩組性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LN組腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化發(fā)生率均高于非LN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 發(fā)生和未發(fā)生LN的系統(tǒng)性紅斑狼瘡兩組基線資料比較

2.2腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較 LN組腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分均高于非LN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 發(fā)生和未發(fā)生LN的系統(tǒng)性紅斑狼瘡兩組腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)水平比較

2.3腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN的診斷價(jià)值分析 腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN均有較高診斷價(jià)值(AUC分別為0.888、0.897)，最佳截?cái)嘀捣謩e為0.34、3.50分。見表3、圖1。

表3 腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分診斷LN的ROC曲線分析

2.4不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較 58例LN中，病理分型為Ⅱ型7例(12.07%)，Ⅲ型11例(18.97%)，Ⅳ型25例(43.10%)，Ⅴ型15例(25.86%)。不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較

2.5腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與LN患者病理分型的相關(guān)性 腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與LN患者病理分型無明顯相關(guān)性(r=0.127、0.131，P=0.275、0.263)。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LN的發(fā)生包括多個(gè)環(huán)節(jié)，如抗DNA抗體與免疫復(fù)合物誘導(dǎo)腎臟損傷、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生致病性自身抗體、輔助性T淋巴細(xì)胞參與激活B淋巴細(xì)胞、核小體增多或異常核小體出現(xiàn)等[9]。故體液免疫、細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)等多種病理過程均參與LN的發(fā)生發(fā)展。近年來，miRNA在腎臟疾病中的作用受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注，部分miRNA可介導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1的表達(dá)及促纖維化蛋白的生成，從而誘導(dǎo)LN發(fā)生[10-11]。目前miR-7977相關(guān)研究較少，但外國學(xué)者指出，miR-7977在LN中表達(dá)水平明顯升高，miR-7977可能參與LN發(fā)病機(jī)制[12]。NR4A1表達(dá)可被多種細(xì)胞因子調(diào)控，在機(jī)體生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)認(rèn)為NR4A1可通過調(diào)控炎性細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程，且在腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡中具有調(diào)控作用，NR4A1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡也成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[13]。也有學(xué)者指出，NR4A1可通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路，在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[14]。因此，miR-7977及NR4A1可能與LN發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本研究就腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)對(duì)LN的診斷價(jià)值及與病理分型的關(guān)系展開分析，為LN的臨床診療提供參考。

本研究結(jié)果顯示，LN組腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化發(fā)生率均高于非LN組。這也與LN患者彌漫性增生致腎小球壞死性病變及腎小管間質(zhì)病變更為嚴(yán)重有關(guān)[15-16]。LN組腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分均高于非LN組，即LN患者腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)水平均升高。推測該結(jié)果由以下2種因素引起：①miR-7977可調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)釋放及淋巴細(xì)胞功能，腎組織miR-7977表達(dá)升高，使炎性介質(zhì)釋放增多、免疫系統(tǒng)紊亂加劇，加速彌漫性增生性病變發(fā)生，引起LN[17]；②NR4A1可介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，并調(diào)控炎癥反應(yīng)，腎組織NR4A1表達(dá)升高，也提示自身免疫性疾病及炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重，更易發(fā)生LN[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)，腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN均有較高診斷價(jià)值。提示miR-7977、NR4A1能夠用于LN的臨床診斷。腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分診斷LN的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.34、3.50分，可供臨床參考。

此外，LN病理分型中以Ⅳ型最嚴(yán)重，具有系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性增生病變，常伴壞死性血管炎及血栓形成，嚴(yán)重影響患者腎功能[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分略低于Ⅳ型患者，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這也提示miR-7977及NR4A1可能在病變較輕的LN患者腎組織中表達(dá)水平低，但由于本研究樣本量有限，未得到顯著性結(jié)論。SAKAI等[20]提出，miRNA可通過多種途徑參與LN的病情進(jìn)展，可作為LN治療的新靶點(diǎn)。然而本研究發(fā)現(xiàn)，LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與病理分型無明顯相關(guān)性，這也可能與本研究樣本量較少，結(jié)果存在偏倚有關(guān)。因此，腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)對(duì)評(píng)估LN病情進(jìn)展有一定參考價(jià)值，但與病情進(jìn)展的關(guān)系仍需后續(xù)研究證實(shí)。

綜上所述，LN患者腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)明顯升高，對(duì)LN診斷價(jià)值較高，或可作為LN診療的新靶點(diǎn)。