張 丹,李國祝,王春蕾
系統(tǒng)性紅斑狼瘡為自身免疫性疾病,好發(fā)于生育期女性,常伴腎臟免疫復(fù)合物沉積[1]。腎小球系膜細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用,受免疫復(fù)合物沉積的影響,可激活并釋放炎性因子,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤,引起并放大炎癥反應(yīng),加重腎臟損傷[2]。狼瘡性腎炎(LN)作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥,可進(jìn)展為終末期腎臟病,及時(shí)、準(zhǔn)確治療對(duì)患者預(yù)后具有重要意義[3]。microRNA(miRNA)是一種高度保守的內(nèi)源性小RNA,可調(diào)控靶基因表達(dá),參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程。近年有學(xué)者指出,miRNA在LN發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位[4]。核受體亞家族4A組成員1(NR4A1)是一種早期基因產(chǎn)物,廣泛參與生物的生長、代謝及炎癥調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn),NR4A1可能參與LN的發(fā)生發(fā)展[5]?;诖耍狙芯窟x取126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡為研究對(duì)象,評(píng)估患者腎組織miR-7977、NR4A1的表達(dá)水平及與LN病理分型的關(guān)系。
1.1一般資料 選取2016年3月—2019年4月我院收治的126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡為研究對(duì)象。根據(jù)腎穿刺活組織病理檢查結(jié)果將系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者分為LN組與非LN組。根據(jù)國際腎臟病學(xué)會(huì)/腎臟病理學(xué)會(huì)工作組制定的病理分型標(biāo)準(zhǔn)[6],評(píng)估LN患者的病理分型,分為輕微病變型LN(Ⅰ型)、系膜增生性LN(Ⅱ型)、局灶性LN(Ⅲ型)、彌漫性LN(Ⅳ型)、膜性LN(Ⅴ型)、硬化性LN(Ⅵ型)。
1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)
1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn):符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];均行經(jīng)皮腎穿刺活組織病理檢查;患者及家屬均簽署知情同意書;經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。
1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn):原發(fā)性腎臟病或其他繼發(fā)性腎臟病;近3個(gè)月行外科手術(shù)或有外傷史;合并內(nèi)分泌系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾??;伴惡性腫瘤;合并腦血管意外或狼瘡性腦病;慢性傳染病或活動(dòng)性感染性疾??;妊娠、哺乳或更年期婦女。
1.3方法
1.3.1miR-7977表達(dá)檢測:126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡進(jìn)行經(jīng)皮腎穿刺活組織病理檢查,取腎組織冷凍研磨后,使用miRNA提取試劑盒(德國QIAGEN)提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(德國QIAGEN),以U6作為內(nèi)參,檢測miR-7977表達(dá)情況,按照2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[8]。
1.3.2NR4A1表達(dá)檢測:取腎組織石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片后脫蠟水化,經(jīng)3%過氧化氫孵育、PBS沖洗、微波法抗原熱修復(fù),然后滴加正常山羊血清封閉液,室溫孵育;分別滴加一抗工作液(上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)4 ℃孵育過夜,復(fù)溫后PBS沖洗,滴加二抗工作液(羊抗兔,南京生興生物技術(shù)有限公司),37 ℃孵育30 min,PBS沖洗后滴加適量DAB;蘇木素復(fù)染5 min,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,鏡檢。免疫組織化學(xué)評(píng)分方法:①根據(jù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分,0分(<5%)、1分(5%~25%)、2分(25%~50%)、3分(50%~75%)、4分(≥75%);②根據(jù)陽性細(xì)胞著色程度評(píng)分,0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野,各視野上述2項(xiàng)評(píng)分相加,計(jì)算5個(gè)視野平均分,即為NR4A1表達(dá)評(píng)分。
1.4觀察指標(biāo) 比較兩組腎組織miR-7977表達(dá)量及NR4A1表達(dá)評(píng)分差異,評(píng)估m(xù)iR-7977表達(dá)量和NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN的診斷價(jià)值,分析miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與LN患者病理分型的相關(guān)性。
2.1基線資料比較 126例系統(tǒng)性紅斑狼瘡中,確診LN 58例(46.03%),未發(fā)生LN 68例(53.97%)。兩組性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LN組腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化發(fā)生率均高于非LN組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。
表1 發(fā)生和未發(fā)生LN的系統(tǒng)性紅斑狼瘡兩組基線資料比較
2.2腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較 LN組腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分均高于非LN組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。
表2 發(fā)生和未發(fā)生LN的系統(tǒng)性紅斑狼瘡兩組腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)水平比較
2.3腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN的診斷價(jià)值分析 腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN均有較高診斷價(jià)值(AUC分別為0.888、0.897),最佳截?cái)嘀捣謩e為0.34、3.50分。見表3、圖1。
表3 腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分診斷LN的ROC曲線分析
2.4不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較 58例LN中,病理分型為Ⅱ型7例(12.07%),Ⅲ型11例(18.97%),Ⅳ型25例(43.10%),Ⅴ型15例(25.86%)。不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。
表4 不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分比較
2.5腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與LN患者病理分型的相關(guān)性 腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與LN患者病理分型無明顯相關(guān)性(r=0.127、0.131,P=0.275、0.263)。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,LN的發(fā)生包括多個(gè)環(huán)節(jié),如抗DNA抗體與免疫復(fù)合物誘導(dǎo)腎臟損傷、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生致病性自身抗體、輔助性T淋巴細(xì)胞參與激活B淋巴細(xì)胞、核小體增多或異常核小體出現(xiàn)等[9]。故體液免疫、細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)等多種病理過程均參與LN的發(fā)生發(fā)展。近年來,miRNA在腎臟疾病中的作用受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注,部分miRNA可介導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1的表達(dá)及促纖維化蛋白的生成,從而誘導(dǎo)LN發(fā)生[10-11]。目前miR-7977相關(guān)研究較少,但外國學(xué)者指出,miR-7977在LN中表達(dá)水平明顯升高,miR-7977可能參與LN發(fā)病機(jī)制[12]。NR4A1表達(dá)可被多種細(xì)胞因子調(diào)控,在機(jī)體生理、病理過程中發(fā)揮重要作用,現(xiàn)認(rèn)為NR4A1可通過調(diào)控炎性細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程,且在腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡中具有調(diào)控作用,NR4A1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡也成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[13]。也有學(xué)者指出,NR4A1可通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路,在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[14]。因此,miR-7977及NR4A1可能與LN發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本研究就腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)對(duì)LN的診斷價(jià)值及與病理分型的關(guān)系展開分析,為LN的臨床診療提供參考。
本研究結(jié)果顯示,LN組腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化發(fā)生率均高于非LN組。這也與LN患者彌漫性增生致腎小球壞死性病變及腎小管間質(zhì)病變更為嚴(yán)重有關(guān)[15-16]。LN組腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分均高于非LN組,即LN患者腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)水平均升高。推測該結(jié)果由以下2種因素引起:①miR-7977可調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)釋放及淋巴細(xì)胞功能,腎組織miR-7977表達(dá)升高,使炎性介質(zhì)釋放增多、免疫系統(tǒng)紊亂加劇,加速彌漫性增生性病變發(fā)生,引起LN[17];②NR4A1可介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡,并調(diào)控炎癥反應(yīng),腎組織NR4A1表達(dá)升高,也提示自身免疫性疾病及炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重,更易發(fā)生LN[18]。本研究也發(fā)現(xiàn),腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分對(duì)LN均有較高診斷價(jià)值。提示miR-7977、NR4A1能夠用于LN的臨床診斷。腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分診斷LN的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.34、3.50分,可供臨床參考。
此外,LN病理分型中以Ⅳ型最嚴(yán)重,具有系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性增生病變,常伴壞死性血管炎及血栓形成,嚴(yán)重影響患者腎功能[19]。本研究發(fā)現(xiàn),Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分略低于Ⅳ型患者,但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這也提示miR-7977及NR4A1可能在病變較輕的LN患者腎組織中表達(dá)水平低,但由于本研究樣本量有限,未得到顯著性結(jié)論。SAKAI等[20]提出,miRNA可通過多種途徑參與LN的病情進(jìn)展,可作為LN治療的新靶點(diǎn)。然而本研究發(fā)現(xiàn),LN患者腎組織miR-7977表達(dá)量、NR4A1表達(dá)評(píng)分與病理分型無明顯相關(guān)性,這也可能與本研究樣本量較少,結(jié)果存在偏倚有關(guān)。因此,腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)對(duì)評(píng)估LN病情進(jìn)展有一定參考價(jià)值,但與病情進(jìn)展的關(guān)系仍需后續(xù)研究證實(shí)。
綜上所述,LN患者腎組織miR-7977、NR4A1表達(dá)明顯升高,對(duì)LN診斷價(jià)值較高,或可作為LN診療的新靶點(diǎn)。