蔡燕 林婕 何金 楊福長 張冬梅 張連虎 王宗華

摘 ?要：小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活動中具有重要的生物學(xué)功能。前期研究表明，MoRho3的缺失對于稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建設(shè)、附著胞萌發(fā)和侵入能力以及對宿主的致病性等表型都存在嚴重缺陷。為了進一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控途徑，通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測了MoRho3的互作蛋白。在眾多假定互作蛋白中，蛋白激酶MoKin1與釀酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母細胞中，KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。為了驗證在稻瘟病菌中MoKin1與MoRho3之間是否存在著相似的調(diào)控途徑，本研究通過分析MoKin1與同源蛋白的進化關(guān)系，序列結(jié)構(gòu)，定位狀態(tài)以及相關(guān)的互作蛋白，揭示了MoKin1的功能特點，為后續(xù)病原菌中MoKin1與MoRho3互作機制的研究，以及病原菌致病機制的解析提供了新的思路和方向。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌;MoRho3;MoKin1;互作分析

中圖分類號：S432.4+4 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Small GTPase MoRho3 plays an important biological role in the rice blast fungus， Magnaporthe oryzae. The preamble research elucidated that the deletion of MoRho3 in this fungus caused serve phenotypic defects， such as ab-normal morphology of conidia， reduction of germination and penetration of appressoria and reduced pathogenicity. In order to understand the mechanism of the regulatory pathways of MoRho3， we adopted the bioinformatics to search the putative interacting protein of MoRho3. We found the homologus protein of Saccharomyces cerevisiae KIN1 and KIN2 in the proteins， named MoKin1. Because the over-expression of KIN1 and KIN2 could rescue some phenotypic defects of △rho3 in S. cerevisiae， in order to verify whether there was a similar regulatory pathway between Mokin1 and MoRho3 in M. oryzae， the study revealed the functional characteristics of Mokin1 by analyzing the evolutionary relationship， sequence structure， localization status and related interaction proteins， which would provide a new basis for the further study of the interaction between Mokin1 and MoRho3 and the pathogenic mechanism of M. oryzae.

Keywords： Magnaporthe oryzae; MoRho3; MoKin1; interaction analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.026

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟?。╮ice blast disease）是水稻生產(chǎn)中最重要的真菌病害之一。每年引起水稻產(chǎn)量的損失數(shù)以億計，造成嚴重的糧食危害[1]。因此，稻瘟病的防控是水稻生產(chǎn)上最重要的任務(wù)。水稻與稻瘟病菌的互作機制是植物與病原物互作的經(jīng)典模型之一，推動了植物病原真菌致病機制和寄主植物抗病機制的研究[2]。目前，主要從水稻的抗病和稻瘟病菌的致病兩個方面進行研究，為水稻抗病品種的培育以及新型殺菌劑的研發(fā)提供理論方面的指導(dǎo)。

稻瘟病菌的分生孢子隨著風(fēng)雨的傳播，散落在健康的水稻葉表皮。孢子分泌出粘液（spore tip mucilage）使其粘附在葉表皮[3]。在濕度適宜的情況下，孢子萌發(fā)，產(chǎn)生芽管。隨后，芽管頂端膨大形成侵染性結(jié)構(gòu)附著胞（appressorium）。附著胞內(nèi)有甘油等，形成巨大的機械膨壓[4]。經(jīng)與水稻相互識別后，附著胞底部形成侵染栓（penetr?ation peg），刺透水稻葉表皮層，進入水稻細胞，形成侵染菌絲（infection hypha），完成侵染[5]。稻瘟病菌的整個侵染過程受到一系列的信號調(diào)控，如cAMP途徑和MAPK途徑等[6]。此外，小G蛋白家族在稻瘟病菌分生孢子的產(chǎn)生和附著胞的侵入等過程中起著重要的作用[7]。

稻瘟病菌小G蛋白Rho家族有Rac1、Cdc42、Rho1、Rho2、Rho3和Rho4共6個成員，它們承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能。如Rac1分別與Chm1和Nox家族互作影響了病原菌的分生孢子形態(tài)建設(shè)以及致病性的產(chǎn)生[8];Cdc42的敲除也降低了病原菌的侵入能力和致病性[9];Rho2參與了cAMP途徑的調(diào)控，能有效的影響附著胞的形成[10]。

前期研究表明Rho3的敲除使稻瘟病菌產(chǎn)生重要的表型缺陷：分生孢子畸形，附著胞侵染能力下降，致病性降低等。同時Rho3-DN（dominant negative，顯性失活突變型）突變體和Rho3-CA （constitutively active，組成性激活突變型）突變體均表現(xiàn)出與野生型不同的表型[11]，說明小G蛋白Rho3對稻瘟病菌致病機制的調(diào)控極其重要。解析Rho3的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控對于理解稻瘟病菌產(chǎn)孢和致病性形成具有重要的意義。同時，也將為尋求可能的藥物靶標位點、生物農(nóng)藥的開發(fā)和病害的防控提供理論上的支撐。

Kin1/PAR-1/MARK家族屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[12]。從單細胞釀酒酵母到哺乳動物，Kin1/PAR-1/MARK激酶家族成員非常保守，具有相同的結(jié)構(gòu)域，包括N端的絲氨酸/蘇氨酸催化結(jié)構(gòu)域（S_TKc）和C端的40個左右的氨基酸組成的調(diào)控結(jié)構(gòu)域（KA1）[13]。某些成員在鄰近催化結(jié)構(gòu)域的位置有一個UBA結(jié)構(gòu)域，其功能并不清楚，但是Rad23 UBA結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合泛素，參與蛋白酶體調(diào)控的蛋白水解[14]。Kin1/PAR-1/MARK激酶家族成員的功能具有多樣性，包括細胞極性、微管穩(wěn)定性、蛋白穩(wěn)定性、胞外信號和細胞周期調(diào)控等[15]。

在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中有6個編碼PAR蛋白的基因：PAR1-6，其中PAR-1主要參與調(diào)控細胞極性以及細胞的不對稱分裂[16]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中KIN1和KIN2是秀麗隱桿線蟲中PAR-1的同源物[17]。研究表明，釀酒酵母中過表達KIN1和KIN2可以明顯的恢復(fù)Rho3缺失突變體的表型缺陷，并且可以使rho3-V51突變體在14 ℃培養(yǎng)下正常存活[18]。同樣的分泌型缺陷突變體cdc42-6也可恢復(fù)表型缺陷，說明蛋白激酶KIN1和KIN2在小G蛋白Rho3和Cdc42調(diào)控的下游途徑中起作用[19]。因此我們在稻瘟病菌中尋找了釀酒酵母KIN1和KIN2的同源蛋白，命名為MoKin1，研究MoKin1是否可以功能互補MoRho3缺失造成的表型缺陷。

本研究對MoKin1的結(jié)構(gòu)特點，細胞定位以及互作蛋白進行初步的分析，為后續(xù)開展MoKin1的功能鑒定提供一個基礎(chǔ)，同時也為開展MoKin1和MoRho3的互作分析以及解析病原菌的致病機制提供一個方向。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

稻瘟病菌（M. oryzae）菌株Ku80在本實驗室保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?稻瘟病菌MoRho3假定互作蛋白的預(yù)測 ?本研究利用釀酒酵母數(shù)據(jù)庫（www.yeastgenome.org）中與Rho3之間具有physical interaction（物理相互作用）和genetic interaction（基因遺傳互作）關(guān)系的蛋白序列在稻瘟病菌Ku80的基因組中進行序列比對，查找稻瘟病菌中的同源蛋白，得到蛋白序列。然后再根據(jù)NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）中的注釋進行整理，視為稻瘟病菌MoRho3的假定互作蛋白。

1.2.2 ?稻瘟病菌中MoRho3與MoKin1的關(guān)系 ? 根據(jù)MoKin1的基因序列，構(gòu)建MoKin1-AD載體，用于酵母雙雜交實驗。所用的載體是pGADT7，引物序列分別是：上游引物5'-TCCCCCGGGGATG TCCAGTAGACCGTCGTCAT-3'和下游引物5'-CG CGGATCCCTAGAGTTTAAGCTCCTTCAATA-3'，酶切位點分別是SmaⅠ和BamHⅠ。同時我們構(gòu)建了MoRho3-CA-BD和MoRho3-DN-BD載體。所用的載體是pGBKT7，引物序列是上游引物5'-CCG GGATCCGTATGCCTTTATCGCTTTGC-3和下游引物5-AACTGCAGCTACATGACGGTGCACTT- 3，酶切位點是BamHⅠ和PstⅠ。利用酵母雙雜交的方法，驗證稻瘟病菌中MoRho3-CA/ DN-BD與MoKin1-AD的互作關(guān)系。同時在3個突變體，MoRho3-KO，MoRho3-CA和MoRho3-DN，中檢測MoKin1的表達量變化。首先提取野生型WT和3個突變體的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA（反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用的是TAKARA的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser），然后使用TAKARA的熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaq II完成qRT-PCR。根據(jù)得到的數(shù)值采用2–ΔΔCT的方法來計算MoKin1在野生型WT和3個突變體中的相對表達量變化。qRT-PCR中看家基因是β-tubulin（XP_368640），引物序列是5-GCTGTCC TCGTCGATCTCGA-3和5-CAGAGCAGGTCA GGTAACGA-3。檢測MoKin1表達量的引物序列是5-GGAAGGAACAACCTGAG-3和5-GAAGC TCTTACGGATGG-3。

1.2.3 ?蛋白激酶MoKin1的結(jié)構(gòu)特點及其進化分析 ? 在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BlastP搜索MoKin1在各種模式真菌中的同源蛋白，選取的模式真菌有禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、釀酒酵母（S. cerevisiae）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、炭疽菌（Colletotrichum tanaceti）、白色念珠菌（Candida albicans）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）和禾柄銹菌（Puccinia coronata）。將上述得到的各模式真菌中Kin1同源蛋白的序列，在ESPript3.0（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）在線軟件中進行序列比對，所有參數(shù)設(shè)置成默認值，得到這些同源蛋白的序列比對圖。同時利用MEGA7.0軟件對Kin1的同源蛋白進行進化樹分析，采用最大似然法（Maximum likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1000次的bootstrap的分析驗證。

根據(jù)得到的各模式真菌中Kin1的同源蛋白，在MEME（https：//meme-suite.org）在線軟件中進行motif的分析;同時在NCBI（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）中進行蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析。

1.2.4 ?蛋白激酶MoKin1在稻瘟病菌中的定位分析 ? 根據(jù)promoter 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ Promoter/）在線軟件預(yù)測了稻瘟病菌MoKin1的啟動子序列，然后設(shè)計引物構(gòu)建MoKin1-GFP的定位載體Kin1G。使用的質(zhì)粒是pKNTG，引物序列分別是：上游引物，5-TGGGCCCTTTAAGCA TTATG GCTTTAGG-3和下游引物，5-CCATC GATGAGTTTAAGCTCCTTCAATAT-3，所使用的酶切位點是ApaⅠ和ClaⅠ。將載體Kin1G轉(zhuǎn)入到Ku80的原生質(zhì)體中，使用G418作為篩選的抗生素，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MoKin1的定位情況。

1.2.5 ?蛋白激酶MoKin1的互作蛋白分析 ?利用STRING（https：//version11.string-db.org/）在線軟件預(yù)測分析與稻瘟病菌MoKin1的互作蛋白。同時根據(jù)酵母數(shù)據(jù)庫中KIN1和KIN2的physical和genetic互作蛋白，同源比對到稻瘟病菌中相應(yīng)的蛋白序列，并進行簡單的GO和KEGG分析，充分理解MoKin1的功能。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?小G蛋白MoRho3的互作蛋白預(yù)測分析

利用酵母數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的Rho3的互作蛋白，在稻瘟病菌比對得到它們的同源蛋白。在酵母數(shù)據(jù)庫（SGD）中，Rho3的互作蛋白分為physical interaction和genetic interaction。而且與Rho3具有g(shù)enetic interaction的互作蛋白有224個（RHO3_genetic_interactors），這些蛋白參與了細胞中多種生命活動。此外，與Rho3具有physical interaction的蛋白有25個，與之相對應(yīng)的稻瘟病菌中的同源蛋白有23個（表1）。通過分析這23個蛋白，最引起我們興趣的是一系列的激酶，比如MGG_03696（CMGC/CK2 protein kinase），MGG_00446（casein kinase II subunit beta-1），MGG_04660（CMGC/CDK/CDK5 protein kinase），MGG_05199（protein kinase regulator Ste50）以及MGG_01279（CAMK/CAMKL/KIN1 protein kinase，命名為MoKin1）。Rho3作為開關(guān)分子，與細胞中激酶的互作豐富了稻瘟病菌中MoRho3調(diào)控的信號通路，對深入解析稻瘟病菌的致病機理提供了新的方向。

前期表明在釀酒酵母（S. cerevisiae）中，過表達Kin1/Kin2可以有效地抑制Rho3的缺失引起酵母細胞的表型缺陷[18]。因此在本研究將重點分析MoKin1的功能，為其后續(xù)的研究工作，如MoKin1和MoRho3的互作，MoKin1參與致病性產(chǎn)生等提供基礎(chǔ)和方向。

2.2 ?稻瘟病菌中MoRho3與MoKin1的關(guān)系

為了明確MoKin1和MoRho3之間的關(guān)系，利用酵母雙雜交的方法，檢測MoKin1-AD和MoRho3-CA/DN-BD之間是否存在著直接互作關(guān)系，但是實驗結(jié)果表明小G蛋白MoRho3和MoKin1之間沒有明顯的互作關(guān)系。為了推測二者之間是否存在遺傳互作的關(guān)系。在突變體MoRho3- KO，MoRho3-CA和MoRho3-DN[11]中觀察MoKin1的表達量變化。結(jié)果顯示與野生型Ku80中相比，在3個突變體中，MoKin1的表達量均明顯下降（圖1）。說明MoRho3的不正常表達，影響了MoKin1正常生理功能，也說明了MoKin1參與了MoRho3的下游調(diào)控路徑。

2.3 ?MoKin1與各個同源蛋白之間的進化關(guān)系以及蛋白結(jié)構(gòu)分析

在NCBI中blast到MoKin1的同源蛋白，利用MEGA 7.0構(gòu)建Kin1各同源蛋白間的ML進化樹（圖2），結(jié)合同源蛋白的序列比對圖（圖3），表明在各個絲狀真菌中Kin1具有非常保守的區(qū)域。進一步分析Kin1同源蛋白的motif，表明各個Kin1同源蛋白具有相同的motif基序和順序（VdKin1和FgKin1，缺少motif7），進一步的說明了Kin1的高度保守性。而且結(jié)構(gòu)域顯示絲狀真菌的Kin1同源蛋白之間都包含有STKc_Kin1_2結(jié)構(gòu)域和MARK_C_like結(jié)構(gòu)域（圖2），與序列比對圖（圖3）中序列保守的區(qū)域正好對應(yīng)。

2.4 ?蛋白激酶MoKin1在稻瘟病菌中的定位分析

為了進一步的分析MoKin1的功能，將構(gòu)建好的Kin1G載體轉(zhuǎn)入到稻瘟病菌Ku80的原生質(zhì)體中用于檢測MoKin1在稻瘟病菌的定位。結(jié)果表明，MoKin1-GFP熒光主要集中在菌絲和分生孢子的隔膜孔處（圖4）。

2.5 ?蛋白激酶MoKin1的假定互作蛋白分析

通過分析比對酵母數(shù)據(jù)庫中KIN1/2的互作蛋白，在NCBI中blast稻瘟病菌的同源蛋白（圖5）。酵母數(shù)據(jù)庫中KIN1/2的互作蛋白分為physical interactors和genetic interactors。通過分析有23個蛋白與KIN1、KIN2均具有physical互作（圖5， KIN1 physical interactors和KIN2 physical interactors共同含有的蛋白），表2所示相應(yīng)的蛋白以及在稻瘟病菌中對應(yīng)的22個同源蛋白。與此同時，這22個同源蛋白的GO富集（圖6）和KEGG富集分析（圖7）結(jié)果表明MoKin1互作蛋白主要參與了細胞生長發(fā)育、蛋白質(zhì)磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等主要生化途徑。

3 ?討論

稻瘟病菌是水稻生產(chǎn)中最嚴重的病害，嚴重的影響了水稻的的產(chǎn)量和質(zhì)量。對于防控病害的發(fā)生，通常采用種植抗病品種的方式。另一方面，研究致病病原的機理也對病害的防控起著理論指導(dǎo)的作用。前期的研究表明小G蛋白MoRho3病原菌的致病性起著重要的調(diào)控作用[11]，因此理解MoRho3的精確功能有助于解析致病機理。本研究依據(jù)酵母數(shù)據(jù)庫中Rho3的互作蛋白，預(yù)測了稻瘟病菌中MoRho3的一些互作蛋白。具有物理互作的同源蛋白有23個（表1），包含7個假定蛋白（蛋白編碼基因是MGG_09923、MGG_ 03323、MGG_03048、MGG_06183、MGG_16213、MGG_05706、MGG_17697），4個細胞核內(nèi)相關(guān)蛋白（蛋白編碼基因是MGG_07120、MGG_ 01268、MGG_13020和MGG_06459），3個蛋白酶體相關(guān)蛋白（蛋白編碼基因是MGG_07120、MGG_16706和MGG_ 04506），2個熱激蛋白（編碼基因是MGG_11513和MGG_06459），1個RNA-binding蛋白（編碼基因MGG_14563），1個胞外分泌復(fù)合體的Exo70亞基（編碼基因是MGG_01760）。除此之外，最引人興趣的屬于5個蛋白激酶，分別是構(gòu)成MoCK2的2個亞基（MGG_03696和MGG_00446）[18]，參與MAPK途徑的MGG_05199[19]，以及MGG_04660和MGG_01279（MoKin1）。通過分析這些互作蛋白，可以初步推斷MoRho3參與很多的細胞生命活動途徑，作為開關(guān)分子具有重要的調(diào)節(jié)功能。

相關(guān)文獻研究表明在釀酒酵母中KIN1/KIN2作為一個抑制蛋白，可以恢復(fù)cdc42、Rho3的缺失所造成的表型缺陷[20-21]，因此推測在稻瘟病菌中是否也存在著相似的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控路徑？本文對KIN1/KIN2在稻瘟病菌中的同源蛋白MoKin1（MGG_01279）進行分析、預(yù)測和蛋白定位研究，為病原菌致病機制的解析提供新的方向和思路。

雖然酵母雙雜交的實驗表明MoRho3與MoKin之間沒有明顯的互作關(guān)系，但是qRT-PCR結(jié)果表明MoRho3與MoKin1之間具有明顯的遺傳互作關(guān)系。在MoRho3的各個突變體中，MoKin1的表達量明顯降低，說明MoKin1受到MoRho3的影響，在MoRho3調(diào)控的下游途徑中承擔(dān)功能。這個結(jié)果也很好的佐證了酵母細胞中過表達的KIN1/2可以恢復(fù)Rho3的缺失造成的表型缺陷。

同時不同模式真菌中Kin1同源蛋白的進化樹和蛋白序列的分析表明，Kin1蛋白在不同的真菌中具有非常高的保守性，且其蛋白結(jié)構(gòu)包含有相同的motif基序和2個主要的結(jié)構(gòu)域，分別是N端的STKc_Kin1_2結(jié)構(gòu)域和C端的MARK_C_ like結(jié)構(gòu)域，部分Kin1同源蛋白具有KAI結(jié)構(gòu)域。其中S_TKc結(jié)構(gòu)域（Catalytic domain of Kin1， Kin2， and similar Serine/Threonine Kinases）是激酶的主要活性中心，起著磷酸化作物底物的作用;而MARK_C_like結(jié)構(gòu)域（C-terminal kinase associated domain 1 （KA1）， a phospholipid binding domain， of microtubule affinity-regulating kinases， and similar domains）主要起調(diào)控作用，調(diào)節(jié)控制激酶的活性。

MoKin1蛋白的亞細胞定位分析表明，MoKin1- GFP的熒光主要集中在菌絲和分生孢子的隔膜孔處。MoKin1的定位與其他絲狀真菌，如禾谷鐮刀菌（F. graminearum），煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中的定位相同，都定位在菌絲的隔膜孔處[22-23]。隔膜孔是稻瘟病菌菌絲細胞間物質(zhì)交流和信息交流的主要通道，結(jié)合MoKin1定位正好在隔膜孔處，推測MoKin1可能具有關(guān)閉和打開隔膜孔的功能，影響著物質(zhì)和信息的交流。在MoKin1的互作蛋白的GO富集分析中，蛋白富集在positive regulation of intracellular signal transduction，調(diào)控著細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

通過比對酵母細胞中KIN1/KIN2的互作蛋白，在稻瘟病菌中對MoKin1的假定互作蛋白做了初步的分析。韋恩圖表明KIN1/KIN2的physical interactors有23個蛋白，表2中做了系統(tǒng)的匯總，這是后續(xù)試驗重點分析的對象。通過GO和KEGG分析，表明MoKin1在稻瘟病菌的生長發(fā)育，蛋白磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要功能。這寫功能與MoKin1的激酶特性以及隔膜孔定位具有一致性。

通過分析蛋白激酶MoKin1的功能，可以增加對小G蛋白調(diào)控途徑的理解，同時進一步的分析MoKin1的互作蛋白的一些功能，可以豐富MoRho3-MoKin1的調(diào)控途徑。在后續(xù)的研究中，將進一步的加深對該途徑的研究，以期得到很好的生物農(nóng)藥靶標位點，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中稻瘟病的防控提供理論上的指導(dǎo)。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)