竇宏雙 梁曉 陳青 伍春玲 劉迎 范東哲 吳巖
摘 ?要:本研究通過比較二斑葉螨為害前后抗、感螨木薯品種轉(zhuǎn)錄組差異,篩選差異表達(dá)基因,并采用qPCR驗(yàn)證水楊酸、茉莉酸信號途徑基因的差異表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明,與螨害前相比,螨害1、8 d后,抗螨木薯品種C1115的差異表達(dá)基因?yàn)?89、587個(gè),感螨木薯品種BRA900的差異表達(dá)基因?yàn)?271、930個(gè),C1115相對于BRA900的差異表達(dá)基因分別為383、251個(gè)。GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要顯著集中在次生代謝物質(zhì)合成、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成和氧化還原反應(yīng)等過程。qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,二斑葉螨為害后,抗螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種C1115的水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7和NPR3的表達(dá)量較為害前呈現(xiàn)先顯著提高后降低的趨勢,而感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種BRA900中上述4個(gè)基因的表達(dá)始終維持在顯著高于為害前的水平。受螨害后抗螨木薯C1115中茉莉酸信號途徑基因JAR1、LOX2和OPR11的表達(dá)量也較為害前顯著提高,而感螨木薯BRA900中這3個(gè)基因的表達(dá)量則降低至顯著低于螨害前的水平,qPCR驗(yàn)證結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明,抗螨木薯品種C1115受螨害后能夠同時(shí)激活水楊酸、茉莉酸信號途徑以抵御二斑葉螨為害,為深入闡明木薯抗螨分子機(jī)理,選育和創(chuàng)制抗螨木薯品種提供了理論參考依據(jù)。
關(guān)鍵詞:二斑葉螨;抗、感木薯品種;轉(zhuǎn)錄組分析;水楊酸信號途徑;茉莉酸信號途徑
中圖分類號:S533 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A
Abstract: To the best of our knowledge, there is no report on transcriptome difference while resistant and susceptible cassava cultivars were infested by pests. In this study, by comparing the transcriptome differences of resistant and sus-ceptible cassava cultivars before and after Tetranychus urticae infestation, we screened the differentially expressed genes, and verified the differential expression of salicylic acid and jasmonic acid pathway genes through qPCR. The results of transcriptome analysis showed that there were 589 and 587 differentially expressed genes in mite-resistant cassava cultivar C1115, 1271 and 930 differentially expressed genes in mite-susceptible cassava cultivar BRA900, and 383 and 251 differentially expressed genes between C1115 and BRA900 respectively. In addition, the Go and KEGG enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were significantly enriched in the secondary metabolite biosynthesis, phenylpropane biosynthesis, flavonoid biosynthesis and redox related reactions. qPCR verification indicated that after infested by T. urticae for 1 d and 8 d, the transcriptions of salicylic acid signaling pathway genes such as PAL2, 4CL3, WRKY7 and NPR3 in the standard mite-resistant cassava cultivar C1115 were first significantly increased and then decreased, while the expression level of the four genes in the standard mite-resistant cassava cultivar BRA900 was significantly higher than those before infestation. Besides, the transcription of jasmonic acid signal pathway genes like JAR1, LOX2 and OPR11 in C1115 was also significantly higher than those before infestation, while the transcription of the three genes in BRA900 was significantly lower than those before infestation. The results speculated that mite-resistant cassava cultivar C1115 could activate salicylic acid and jasmonic acid signaling pathways to defend T. urticae infestation. This study would lay a theoretical foundation for further elucidating the molecular mechanism of cassava resistance to mite, and for breeding and creating mite-resistant cassava cultivars.
Keywords: Tetranychus urticae; mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars; transcriptome analysis; salicylic acid signaling pathways; jasmonic acid signaling pathways
DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.013
木薯(Manihot esculenta Crantz)是全球9億多人的主糧,同時(shí)也是重要的飼料作物、工業(yè)原料作物和生物能源[1]。木薯作為“先鋒作物”,在我國農(nóng)業(yè)外交和對外科技援助中發(fā)揮著舉足輕重的作用。我國生產(chǎn)的木薯絕大部分用于制備乙醇,在玉米等糧食作物作為乙醇生產(chǎn)原料供給不足導(dǎo)致燃料乙醇產(chǎn)業(yè)遇到瓶頸的形勢下,發(fā)展“非糧”燃料乙醇已成為世界燃料乙醇技術(shù)的發(fā)展趨勢[2]。2018年8月22日國務(wù)院常務(wù)會議明確提出堅(jiān)持加快建設(shè)木薯燃料乙醇的項(xiàng)目,木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展一直受到國家各級管理部門的高度重視[3]。二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch)是世界危險(xiǎn)性害螨,其寄主多達(dá)50科200余種[4-5]。二斑葉螨是為害木薯最嚴(yán)重的四大有害生物之一,嚴(yán)重暴發(fā)成災(zāi)主要集中在木薯種植后6~8個(gè)月左右,此時(shí)的木薯地已封行,化學(xué)藥劑防治困難[6-7]。
培育與利用抗蟲品種是國內(nèi)外公認(rèn)的最經(jīng)濟(jì)、最有效、最簡便的一項(xiàng)帶有方向性的害蟲防治途徑[8-9],而闡明作物的抗蟲性機(jī)理能夠?yàn)檫x育抗蟲品種提供理論依據(jù)。作物抗蟲性是多個(gè)基因、酶、蛋白和代謝物共同參與調(diào)控的結(jié)果,具有典型的數(shù)量遺傳防御效應(yīng)特征[10],因此,作物抗蟲性的形成原因及可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制需要通過多維度、多因素、多級聯(lián)關(guān)系進(jìn)行考量,而轉(zhuǎn)錄組測序分析是開展作物抗蟲性機(jī)理研究的強(qiáng)有力工具,已廣泛應(yīng)用于多種作物抗蟲基因的篩選、挖掘和功能驗(yàn)證。
水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的防御信號途徑在作物抗蟲性形成過程中發(fā)揮著重要作用,在植物受到害蟲為害時(shí)能激活體內(nèi)相應(yīng)的防御基因表達(dá),可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生影響昆蟲消化的防御蛋白或?qū)ハx有毒害作用的次生代謝物質(zhì)的直接防御[11-13],也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生植物釋放對昆蟲有趨避作用或吸引天敵的揮發(fā)物的間接防御[14-15]。當(dāng)前關(guān)于水楊酸和茉莉酸信號途徑在擬南芥[16]、煙草[17]等模式植物,水稻[18]、小麥[19]、棉花[20]等大宗經(jīng)濟(jì)作物抗蟲性的作用機(jī)制研究已有較多報(bào)道。
當(dāng)前尚未見害蟲為害后抗、感木薯品種轉(zhuǎn)錄組差異分析相關(guān)報(bào)道。因此,本研究通過比較二斑葉螨為害后抗、感螨木薯品種轉(zhuǎn)錄組差異,篩選水楊酸、茉莉酸差異表達(dá)基因,并通過qPCR驗(yàn)證這兩個(gè)信號途徑關(guān)鍵基因的差異表達(dá),以期初步闡明木薯抗螨性機(jī)理,為抗螨木薯品種選育和分子設(shè)計(jì)育種提供理論基礎(chǔ)。
1 ?材料與方法
1.1 ?材料
1.1.1 ?供試木薯 ?本研究選擇遺傳穩(wěn)定、健康無病蟲的抗螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種C1115和感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種BRA900作為供試木薯[3]。C1115和BRA900均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家木薯種質(zhì)資源圃提供。
1.1.2 ?供試蟲源 ?二斑葉螨為本實(shí)驗(yàn)室以感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種BRA900植株長期繼代飼養(yǎng)的室內(nèi)試驗(yàn)種群。飼養(yǎng)溫度為(26±1) ℃,相對濕度為80%。
1.1.3 ?供試試劑 ?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自于天根生化科技(北京)有限公司,cDNA合成試劑盒、去基因組DNA試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,qPCR試劑盒購自于鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司。瓊脂糖、乙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純試劑。
1.2 ?方法
1.2.1 ?二斑葉螨接種和取樣 ?二斑葉螨接種和取樣參照實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行[21],為保證試驗(yàn)材料的一致性和方法的準(zhǔn)確性。選取溫室種植3個(gè)月、長勢一致、無病蟲的C1115和BRA900健康植株,發(fā)育一致的二斑葉螨雌成螨按50頭/葉分別接種于抗、感木薯植株中下部3張葉片背面,再用浸潤甘油的棉絮包裹住木薯葉柄基部以防止二斑葉螨在葉片間遷移。分別在二斑葉螨接種為害前(0 d,對照)、接種為害后1、8 d采集葉片用于水楊酸、茉莉酸含量測定及RNA提取。每品種設(shè)3個(gè)重復(fù),每重復(fù)取中下部3張葉片(1個(gè)重復(fù)3張葉片)。
1.2.2 ?二斑葉螨為害后轉(zhuǎn)錄組差異分析 ?采用1.2.1的方法進(jìn)行二斑葉螨的接種和木薯葉片取樣。取樣后的木薯葉片馬上放入液氮中粉碎研磨,并取不同處理各0.5 g樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測定。去除原始數(shù)據(jù)的接頭序列和低質(zhì)量reads得到clean data。計(jì)算Phred數(shù)值大于30的堿基占總體堿基的百分比Q30,當(dāng)這2個(gè)數(shù)值均大于90%時(shí)表示測序的質(zhì)量良好,能夠滿足建庫的要求。將clean data與木薯參考基因(http://www.cassava-genome.cn/ index.jsp)進(jìn)行序列比對,獲得mapped data。對樣品組中的基因表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)、GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(https://www.kegg.jp/ kegg/pathway.html)通路富集分析。在差異表達(dá)基因篩選方面,從差異倍數(shù)和顯著水平2個(gè)水平進(jìn)行評估,閾值設(shè)定一般為|log2(Fold Change)|>1且qvalue<0.005。差異基因GO富集分析方面,選擇直觀反映生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO條目上差異基因的個(gè)數(shù)分布情況,最終挑選富集最顯著的30個(gè)GO條目作圖展示。KEGG富集程度通過rich factor、Q value和富集到此通路上的基因個(gè)數(shù)來衡量。其中rich factor指差異表達(dá)的基因中位于該pathway條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數(shù)的比值。rich factor越大,表示富集的程度越大。Q value是做過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P value,Q value的取值范圍為[0,1],越接近于零,表示富集越顯著,最終挑選富集最顯著的20條pathway條目作圖展示。
1.2.3 ?差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證 ?以1.2.2轉(zhuǎn)錄組分析中篩選出的差異表達(dá)的水楊酸、茉莉酸信號途徑基因?yàn)闃颖?,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,進(jìn)一步篩選具有指示和標(biāo)記作用的水楊酸和茉莉酸途徑關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。采用1.2.1的方法進(jìn)行二斑葉螨的接種和取樣。采用天根公司(TIANGEN)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取螨害前后的木薯葉片RNA,用Nanodrop和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取去除gDNA后的RNA樣品1.0 μg用于cDNA的合成。cDNA樣品經(jīng)無核酸酶水5倍稀釋后作為qRT-PCR的模板,分別以木薯Metub為內(nèi)參基因,相關(guān)基因的引物信息如表1所示。qPCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)溫育1 min后,以40個(gè)循環(huán)完成如下程序:95 ℃變性15 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s。分別以來源于未經(jīng)二斑葉螨為害的木薯葉片cDNA為對照,螨害后的木薯水楊酸、茉莉酸途徑基因表達(dá)量變化情況以為害前的相對倍數(shù)表示,根據(jù)Livak等[22]的2-ΔΔCT方法計(jì)算而得,每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
1.3 ?數(shù)據(jù)處理
采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多組數(shù)據(jù)的顯著性差異分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法,所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值,顯著性水平為α=0.05。
2 ?結(jié)果與分析
2.1 ?二斑葉螨為害后轉(zhuǎn)錄組差異分析
2.1.1 ?轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 ?由表2可看出,6個(gè)處理的18個(gè)木薯樣品的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)總共得到6.93 G的clean data。質(zhì)量分析結(jié)果顯示,18個(gè)木薯樣品Q30堿基百分比分別均超過90.00%,表明18個(gè)木薯轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的數(shù)量與質(zhì)量都己合格,可進(jìn)行下一步分析。
2.1.2 ?差異表達(dá)分析 ?用于轉(zhuǎn)錄組分析的抗、感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種受螨害1、8 d后的癥狀如圖1所示,隨螨害時(shí)間的延長,感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種BRA900葉片枯黃褪綠的癥狀越發(fā)明顯,而抗螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種C1115葉片無顯著螨害癥狀。圖2結(jié)果表明,與為害前(0 d)相比,受二斑葉螨為害1 d后,抗螨木薯C1115共有1023個(gè)基因差異表達(dá),其中540個(gè)基因上調(diào)表達(dá),483個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2A);為害8 d后共有1684個(gè)基因差異表達(dá),其中757個(gè)基因上調(diào)表達(dá),927個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2B);與為害前(0 d)相比,受二斑葉螨為害1 d后,感螨木薯BRA900共有2137個(gè)基因差異表達(dá),其中1001個(gè)基因上調(diào)表達(dá),1136個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2C);為害8 d后共有1751個(gè)基因差異表達(dá),其中907個(gè)基因上調(diào)表達(dá),844個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2D)。進(jìn)一步對抗感木薯品種間的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析表明,受二斑葉螨為害1 d后,抗螨木薯相較于感螨木薯品種共有882個(gè)基因差異表達(dá),其中358個(gè)基因上調(diào)表達(dá),524個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2E);受二斑葉螨為害8 d后,抗螨木薯相較于感螨木薯品種共有251個(gè)基因差異表達(dá),其中102個(gè)基因上調(diào)表達(dá),149個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2F)。二斑葉螨為害前(0 d)、為害1、8 d后,共同差異表達(dá)的基因有91個(gè),其中48個(gè)上調(diào)表達(dá),43個(gè)下調(diào)表達(dá)(圖3)。
2.1.3 ?差異表達(dá)基因的GO及KEGG富集分析 ?圖4結(jié)果表明,對于不同樣本間的比較,GO的功能注釋均集中在生物學(xué)過程(biological process)和分子功能(molecular function)這兩大類。其中受二斑葉螨為害1、8 d后,抗、感螨木薯品種間在生物學(xué)過程中富集差異基因個(gè)數(shù)最多的均為氧化還原過程(oxidation-reduction process)、單有機(jī)體代謝過程(single-organism metabolic process)(1 d)、代謝過程(metabolic process)和碳水化合物代謝過程(carbohydrate metabolic process)(8 d),而為害1、8 d后在分子功能方面富集差異基因個(gè)數(shù)最多的為氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)和催化活性(catalytic activity)。KEGG富集分析方面(圖5),抗、感螨木薯品種差異表達(dá)基因分別富集到125條和132條,選取的顯著富集的20個(gè)條目中,與作物抗蟲性關(guān)系最密切的通路有次生代謝物質(zhì)生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、苯丙烷生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)。
2.2 ?抗、感螨木薯品種被二斑葉螨為害后差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證
2.2.1 ?用于qPCR驗(yàn)證的水楊酸、茉莉酸信號途徑基因的篩選 ?在通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得的二斑葉螨為害后木薯水楊酸、茉莉酸信號途徑差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步參考前人研究已經(jīng)明確的具有指示和標(biāo)記作用的2個(gè)信號途徑關(guān)鍵基因,最終篩選了木薯水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7、NPR3和茉莉酸信號途徑JAR1、LOX2和OPR11作為qPCR驗(yàn)證的基因(表2)。
2.2.2 ?二斑葉螨為害后水楊酸信號途徑差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證 ?圖6A結(jié)果表明,抗螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種C1115水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7和NPR3的表達(dá)量表現(xiàn)出隨螨害時(shí)間延長而顯著降低的趨勢,其中螨害1 d后表達(dá)量達(dá)到峰值,4個(gè)基因表達(dá)量分別為螨害前(0 d)的5.11、3.74、2.40、1.92倍。而感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種BRA900上述4個(gè)基因的表達(dá)量在螨害后均維持在顯著高于螨害前的水平(P<0.05)(圖6B)。在同一螨害時(shí)間內(nèi),相對于BRA900,C1115中PAL2、4CL3和NPR3基因的表達(dá)量在螨害1 d時(shí)顯著上調(diào),而在螨害8 d時(shí)顯著下調(diào)(圖6C),這與轉(zhuǎn)錄組分析的基因差異表達(dá)結(jié)果具有一致性。
2.2.3 ?二斑葉螨為害后茉莉酸信號途徑差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證 ?圖7A結(jié)果表明,抗、感螨參照標(biāo)準(zhǔn)木薯品種被二斑葉螨為害后,茉莉酸信號途徑基因的表達(dá)量變化趨勢并不完全一致??跪臼鞢1115受螨害后,茉莉酸信號途徑基因JAR1、LOX2和OPR11的表達(dá)量與螨害前相比均顯著提
高(P<0.05),表達(dá)量的最高值均出現(xiàn)在螨害后1 d,分別達(dá)到了螨害前的7.16、7.28、8.50倍,隨螨害時(shí)間的延長,表達(dá)量均表現(xiàn)出下降的趨勢。而感螨木薯BRA900受螨害后,上述3個(gè)基因的表達(dá)量也隨著螨害時(shí)間的延長逐漸降低,并且螨害8 d后JAR1和LOX2的表達(dá)量顯著降低至低于螨害前的水平(P<0.05)(圖7B)。此外,螨害前,抗螨品種C1115中JAR1、LOX2和OPR11的表達(dá)量僅分別為感螨品種BRA900的1.15倍、1.14倍和1.57倍,而受螨害1 d和8 d后,上述3個(gè)基因在C1115中的表達(dá)量均顯著高于BRA900(P<0.05)(圖7C)。上述茉莉酸信號途徑基因qPCR驗(yàn)證的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的差異表達(dá)情況基本一致。
3 ?討論
轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明,與未受螨害之前相比,隨著螨害時(shí)間的延長,抗螨木薯品種C1115的差異表達(dá)基因數(shù)基本保持不變,而感螨木薯品種BRA900的差異表達(dá)基因數(shù)則顯著下降,并且抗螨木薯相對于感螨木薯的差異表達(dá)基因也呈現(xiàn)出隨螨害時(shí)間延長而顯著下降的趨勢。推斷抗螨木薯品種在螨害期間能夠穩(wěn)定激活自身的防御反應(yīng),而感螨木薯品種因螨害后植株嚴(yán)重受損,體內(nèi)的多個(gè)生化反應(yīng)可能停止或被抑制。這在煙粉虱為害抗感棉花品種[30]、枕葉盲蝽為害抗感水牛草品種[31]的轉(zhuǎn)錄組分析中也能觀察到與本研究相類似的結(jié)果。差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析結(jié)果表明,差異表達(dá)基因主要富集在次生代謝物質(zhì)合成、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成和氧化還原相關(guān)反應(yīng)方面,而這些生物學(xué)過程又與作物抗蟲性息息相關(guān),尤其是苯丙烷合成通路的激活是啟動水楊酸信號途徑的關(guān)鍵[32],而植物內(nèi)源茉莉酸亦能夠激活類黃酮生物合成途徑[33]。因此本研究轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果可以總體上大致反映抗、感螨木薯品種抗性差異的分子基礎(chǔ)。
水楊酸和茉莉酸途徑是植物抵御害蟲、病原菌和病毒等有害生物入侵過程中研究最廣泛的2條防御信號途徑。因此,本研究從轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異表達(dá)基因中選擇了具有代表性的指示和標(biāo)記基因PAL2、4CL3、WRKY7、NPR3(水楊酸途徑)和JAR1、LOX2、OPR11(茉莉酸途徑)做進(jìn)一步的qPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,上述基因在轉(zhuǎn)錄組分析中的差異表達(dá)情況和qPCR驗(yàn)證的結(jié)果基本一致,并且qPCR分析結(jié)果還顯示2個(gè)途徑基因的表達(dá)量變化取食并不一致。許多研究表明,雙子葉植物中JA和SA防御信號途徑既有相互拮抗[34-35],也存在相互協(xié)同[36-37],這2個(gè)信號途徑之間表現(xiàn)出何種相互作用模式和害蟲和作物的種類有關(guān)。一些研究表明刺吸式昆蟲為害后可誘導(dǎo)水楊酸信號途徑的激活,而抑制茉莉酸信號途徑。如煙粉虱為害利馬豆和擬南芥后,植物內(nèi)源水楊酸含量及其調(diào)控的防御基因的表達(dá)量均增加,同時(shí)抑制內(nèi)源茉莉酸含量及其調(diào)控的防御基因的表達(dá)[38]。B型煙粉虱能夠誘導(dǎo)擬南芥的水楊酸途徑基因并抑制茉莉酸途徑基因的表達(dá)[39]。煙粉虱為害番茄后,主要誘導(dǎo)水楊酸防御反應(yīng),同時(shí)抑制茉莉酸防御反應(yīng),如何瑜晨[34]研究測定了茉莉酸信號路徑上LOX-D基因的表達(dá)情況,結(jié)果表明,LOX-D在煙粉虱為害12 h時(shí)其表達(dá)量顯著增加,但隨著為害時(shí)間延長,其表達(dá)量逐漸降低,并恢復(fù)到對照水平。也有研究表明,刺吸式害蟲為害能同時(shí)激活植物的水楊酸和茉莉酸途徑。如姚新建[40]研究發(fā)現(xiàn)抗性小麥品系35-E4和敏感品系35-A20被禾谷縊管蚜為害后,其水楊酸和茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因(PAL、LOX、NPR)的表達(dá)量均顯著提高,但是表達(dá)模式存在差異,抗性品系35-E4中相關(guān)基因的表達(dá)量高于敏感品系35-A20。張羽宇等[41]研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬為害能顯著誘導(dǎo)菜豆植株茉莉酸和水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)防御酶基因LOX,PAL和PR-2的表達(dá),并在菜豆植株不同部位葉片產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。趙麗艷[42]研究發(fā)現(xiàn),蚜蟲為害既激活了水楊酸信號途徑基因如PAL、4CL的表達(dá),也激活了茉莉酸信號途徑基因LOX的表達(dá)。上述研究表明不同刺吸式口器害蟲為害不同寄主植物后,SA和JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)卻顯著不同。本研究結(jié)果表明,二斑葉螨為害后抗螨木薯C1115和感螨木薯BRA900后水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7和NPR3均能夠被顯著誘導(dǎo),而抗、感木薯中,茉莉酸信號途徑基因JAR1、LOX2和OPR11的表達(dá)量在為害早期(1 d)均較為害前顯著提高。然而隨著為害時(shí)間的延長,上述3個(gè)基因的表達(dá)量雖然在抗螨木薯C1115中逐漸降低,但依然維持在顯著高于螨害前的水平,而在感螨木薯BRA900中這3個(gè)基因的表達(dá)量降低至顯著低于螨害前的水平,一方面說明二斑葉螨可能采取了和煙粉虱相同的為害策略,即通過誘導(dǎo)水楊酸途徑,抑制茉莉酸途徑達(dá)到為害感螨木薯的目的,而抗螨木薯的茉莉酸途徑均能被誘導(dǎo)產(chǎn)生防御反應(yīng)免于受害。
本研究從轉(zhuǎn)錄組分析、水楊酸、茉莉酸途徑關(guān)鍵差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證角度初步解析了抗、感木薯品種存在抗性差異的可能原因,但僅從基因表達(dá)層面仍不能充分闡明木薯的抗螨性機(jī)理,后續(xù)研究可采用多組學(xué)聯(lián)合分析的深入探討基因-蛋白-代謝物的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),挖掘并驗(yàn)證關(guān)鍵抗蟲基因的功能,以期系統(tǒng)全面闡明木薯品種的抗螨性機(jī)理。
參考文獻(xiàn)
[1] 歐文軍, 韋卓文, 梁海波, 等. 推動中非木薯科技合作 服務(wù)國家“一帶一路”戰(zhàn)略[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè), 2016(4): 9-12.
[2] 王 ?霞, 陳迪嘉, 葉廣英, 等. 我國非糧作物燃料乙醇技術(shù)與產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 新能源進(jìn)展, 2014, 2(2): 89-93.
[3] Chen Q, Liang X, Wu C L, et al. Density threshold-based acaricide application for the two-spotted spider mite Tetra-nychus urticae on cassava: from laboratory to the field [J]. Pest Management Science, 2019, 75(10): 2634- 2641.
[4] 匡海源. 農(nóng)螨學(xué)[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1986.
[5] 程立生. 應(yīng)重視二斑葉螨在我國的傳播危害[J]. 植物保護(hù), 1999, 25(4): 57-58.
[6] 張 ?鈞. 國外木薯害蟲研究概況[J]. 熱帶作物研究, 1982, 2(4): 81-87.
[7] 陳 ?青, 梁 ?曉, 伍春玲, 等. 木薯抗螨種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新利用研究進(jìn)展[C]//2019年全國熱帶作物學(xué)術(shù)年會論文集. 西安, 2019: 337.
[8] Painter R H. Insect resistance in crop plants[J]. 1951, 72(6): 481.
[9] 欽俊德, 王琛柱. 論昆蟲與植物的相互作用和進(jìn)化的關(guān)系[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2001, 44(3): 360-365.
[10] Stotz H U, Pittendrigh B R, Kroymann J, et al. Induced plant defense responses against chewing insects. ethylene signaling reduces resistance of Arabidopsis against Egyptian cotton worm but not diamondback moth[J]. 2000, 124(3): 1007-1018.
[11] Sabelis M W, Janssen A, Kant M R. The enemy of my ene-my is my ally[J]. Science, 2001, 291(5511): 2104-2105.
[12] Liechti R. The jasmonate pathway[J]. Science, 2002, 296 (5573): 1649-1650.
[13] 尹 ?姣, 陳巨蓮, 曹雅忠, 等. 茉莉酸誘導(dǎo)小麥抗病蟲性初步研究[J]. 植物保護(hù), 2005(4): 36-38.
[14] 呂要斌, 劉樹生. 外源茉莉酸誘導(dǎo)植物反應(yīng)對菜蛾絨繭蜂寄生選擇行為的影響[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2004, 47(2): 206-212.
[15] 馮遠(yuǎn)嬌, 王建武, 駱世明. 外源茉莉酸處理地下部對玉米化學(xué)防御反應(yīng)影響的時(shí)間和濃度效應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 20(8): 1883-1890.
[16] Phuong L T, Fitrianti A N, Luan M T, et al. Antagonism between SA- and JA-signaling conditioned by saccharin in Arabidopsis thaliana renders resistance to a specific patho-gen[J]. Journal of General Plant Pathology, 2020, 86(2): 86-99.
[17] Xu H X, Qian L X, Wang X W, et al. A salivary effector enables whitefly to feed on host plants by eliciting salicylic acid-signaling pathway[J]. PNAS, 2019, 116(2): 490-495.
[18] Yonny M E, Ballesteros-Gómez A, Toscano Adamo M L, et al. Supramolecular solvent-based high-throughput sample treatment for monitoring phytohormones in plant tissues[J]. Talanta, 2020, 219: 121249.
[19] El-Wakeil N E, Volkmar C, Sallam A A. Jasmonic acid induces resistance to economically important insect pests in winter wheat[J]. Pest Management Science, 2010, 66(5): 549-554.
[20] Guo Q, Zhao L, Fan X Q, et al. Transcription factor GarWRKY5 is involved in salt stress response in diploid cotton species (Gossypium aridum L.)[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(21): 5244.
[21] Lu F P, Liang X, Lu H, et al. Overproduction of superoxide dismutase and catalase confers cassava resistance to Tetra-nychus cinnabarinus[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1-13.
[22] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene ex-pression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.
[23] 溫 ?娟, 郅軍銳, 呂召云, 等. 二斑葉螨為害對番茄葉片主要營養(yǎng)物質(zhì)和防御酶活性的影響[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào), 2017, 39(1): 172-180.
[24] 任倩倩. 抗、感茶樹品種對茶小綠葉蟬取食誘導(dǎo)的防御反應(yīng)[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2020.
[25] Kim K C, Fan B F, Chen Z X. Pathogen-induced Arabidop-sis WRKY7 is a transcriptional repressor and enhances plant susceptibility to Pseudomonas syringae[J]. Plant Physiology, 2006, 142(3): 1180-1192.
[26] Ding Y L, Sun T J, Ao K, et al. Opposite roles of salicylic acid receptors NPR1 and NPR3/NPR4 in transcriptional reg-ulation of plant immunity[J]. Cell, 2018, 173(6): 1454- 1467.
[27] Staswick P E, Tiryaki I, Rowe M L. Jasmonate response locus JAR1 and several related Arabidopsis genes encode enzymes of the firefly luciferase superfamily that show ac-tivity on jasmonic, salicylic, and indole-3-acetic acids in an assay for adenylation[J]. Plant Cell, 2002, 14(6): 1405-1415.
[28] 呂 ?敏, 蘇建坤, 白和盛, 等. 桃蚜取食和機(jī)械損傷對番茄和辣椒PAL、LOX和PPO活性的誘導(dǎo)作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 32(6): 1273-1279.
[29] 張海波. 煙粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)取食及外源JA處理對辣椒(Capisicum annuum L.)內(nèi)源JA、SA的影響[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2018.
[30] Li J Y, Zhu L Z, Hull J J, et al. Transcriptome analysis reveals a comprehensive insect resistance response mechanism in cotton to infestation by the phloem feeding insect Bemisia tabaci (whitefly)[J]. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(10): 1956-1975.
[31] Postnikova O A, Hult M, Shao J, et al. Transcriptome analysis of resistant and susceptible alfalfa cultivars infected with root-knot nematode Meloidogyne incognita[J]. PLoS One, 2015, 10(2): e0118269.
[32] Boba A, Kostyn K, Kostyn A, et al. Methyl salicylate level increase in flax after Fusarium oxysporum infection is asso-ciated with phenylpropanoid pathway activation[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 7: 1951.
[33] Gadzovska S, Maury S, Delaunay A, et al. Jasmonic acid elicitation of Hypericum perforatum L. cell suspensions and effects on the production of phenylpropanoids and naphto-dianthrones[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2007, 89(1): 1-13.
[34] 何瑜晨. 茉莉酸及水楊酸信號路徑在番茄防御煙粉虱中的作用研究[D]. 杭州: 中國計(jì)量大學(xué), 2017.
[35] Agut B, Gamir J, Jaques J A, et al. Tetranychus urticae -triggered responses promote genotype-dependent conspe-cific repellence or attractiveness in Citrus[J]. New Phytology, 2015, 207(3): 790-804.
[36] Niki T, Mitsuhara I, Seo S, et al. Antagonistic effect of salicylic acid and jasmonic acid on the expression of pathogenesis-related (PR) protein genes in wounded mature tobacco leaves[J]. Plant & Cell Physiology, 1998, 39(5): 500-507.
[37] Koornneef A, Pieterse C M J. Cross talk in defense signal-ing[J]. Plant Physiology, 2008, 146(3): 839-844.
[38] Zhang P J, Zheng S J, Van Loon J J A, et al. Whiteflies interfere with indirect plant defense against spider mites in Lima bean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(50): 21202-21207.
[39] Zarate S I, Kempema L A, Walling L L. Silverleaf whitefly induces salicylic acid defenses and suppresses effectual jasmonic acid defenses[J]. Plant Physiology, 2007, 143(2): 866-875.
[40] 姚新建. 13個(gè)小麥種質(zhì)對兩種蚜蟲的抗性機(jī)理與抗蚜基因的驗(yàn)證及研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2018.
[41] 張羽宇, 郅軍銳, 劉 ?勇, 等. 西花薊馬取食對菜豆不同部位葉片防御基因表達(dá)的影響[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2017, 60(1): 1-8.
[42] 趙麗艷. 麥長管蚜取食為害誘導(dǎo)小麥防御反應(yīng)的生化及分子機(jī)制[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2006.
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