曾凡云 王艷瑋 漆艷香 謝藝賢 張欣 彭軍

摘 ?要：本研究克隆鑒定了香蕉枯萎病菌4號生理小種（Foc4）的細胞周期蛋白C1（Fusarium Cyclin C1，F(xiàn)CC1）基因FocFCC1，采用Split-marker同源重組技術獲得基因敲除突變體ΔFocFCC1，通過比較突變體和野生菌株在生長速度、產(chǎn)孢量和致病力等方面的差異，探索了FocFCC1基因缺失對香蕉枯萎病菌生物學功能的影響，并評估了FocFCC1作為枯萎菌內源報告基因的可行性。結果表明：與Foc4野生型菌株相比，ΔFocFCC1菌絲生長緩慢、菌絲畸形及產(chǎn)孢量減少，對巴西蕉苗的致病力明顯減弱，推測FocFCC1基因在Foc4的生長發(fā)育、產(chǎn)孢及致病力等方面具有重要作用。以FocFCC1為靶標基因，評估了兩種基因敲除重組方法介導的基因敲除效率，利用紅色表型作為判斷依據(jù)，挑取再生板上有紅色表型的轉化子進行PCR檢測，Split-marker重組方法獲得陽性轉化子比例為91.7%，而多片段裝配融合方法獲得陽性轉化子的比例為64%。ΔFocFCC1出現(xiàn)典型紅色菌落，紅色表型與PCR檢測的FocFCC1陽性敲除轉化子一一對應，F(xiàn)ocFCC1基因敲除后紅色表型肉眼容易分辨，可作為香蕉枯萎病菌內源報告基因探索新的遺傳操作技術在該菌上應用的可行性。

關鍵詞：香蕉枯萎菌;細胞周期蛋白C1;基因敲除;表型分析;致病力

中圖分類號：S668.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： In this study， the Fusarium Cyclin C1 gene FocFCC1 in F. oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc4） was cloned and identified. The ΔFocFCC1 gene-knockout mutants were obtained by the Split-marker homologous recombination technique. The growth rate， sporulation， pathogenicity were studied to investigate the biological function of FocFCC1 in Foc4. Additionally， we evaluated whether the FocFCC1 could serve as an endogenous reporter gene applied in Foc4. The results demonstrated that ΔFocFCC1 showed slow growth rate， hyphal deformity， decreased conidium production， and significantly reduced pathogenicity to banana （Cavendish， AAA）. Therefore， we hypothesized that FocFCC1 gene might play an important role in the growth， sporulation and pathogenicity of Foc4. Further， a comparative study of the efficiency of two different homologous DNA disruption construct methods was carried out， one is Split-marker recom-bination approach， another termed Multi-fragment assembly by In-fusion cloning， requires only one standard PCR reaction and one fragment assembly reaction. Using the red phenotype as the judging basis， the transformants with red phenotype on the regeneration plate were selected for PCR detection. The results showed the percentage of positive transformants of Split-marker recombination approach was 91.7%， while that of the Multi-fragment assembly by In-Fusion cloning method was 64%. Next， ΔFocFCC1 showed typical red colony distinguished with Foc4， and the red colony phenotypes coupled with the positive PCR amplification bands. It is important that positive transformants can pick up according to the red phenotype by eyes without PCR procedures， and can serve as endogenous reporter gene for further Foc4 molecular biology research.

Keywords： Fusarium. oxysporum f. sp. cubense; Fusarium Cyclin C1; gene knockout; phenotype analysis; patho-genicity test

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.011

香蕉枯萎?。‵usarium oxysporum f. sp. cu-bense，F(xiàn)oc）是破壞香蕉維管束導致植株死亡的毀滅性土傳病害，是香蕉產(chǎn)業(yè)上最關注的焦點問題之一，也是熱帶地區(qū)植物病理學研究的熱點之一。隨著真菌遺傳操作技術的發(fā)展和成熟，利用遺傳操作技術研究香蕉枯萎病菌的基因功能也日趨成熟，但是相對模式病原菌而言，香蕉枯萎病菌的研究中很多新的分子生物學技術還沒有被完全建立并應用，因此迫切需要鑒定內源報告基因并以此評估新技術應用的可行性。建立在遺傳轉化基礎上的基因敲除（gene knockout）及沉默（gene silencing，RNAi）是研究Foc4基因功能的重要分子生物學手段[1]。目前香蕉枯萎病菌尚無內源報告基因的相關報道，而建立可靠的遺傳轉化技術并高效刪除目的基因是進行基因功能分析的重要前提，選擇重復性好、表型容易分辨的內源報告基因作為快速篩選標記，可評估遺傳轉化效率以及其他新技術在枯萎病菌上應用的可行性。

報告基因（reporter gene）是現(xiàn)代分子生物學研究領域中被廣泛使用的一類重要工具，在植物基因功能研究中發(fā)揮重要作用。β-葡糖醛酸酶（GUS）基因具有很多優(yōu)點，在細胞內表達穩(wěn)定且半衰期長，檢測方法簡便多樣，作為外源報告基因在植物功能基因研究中得到了廣泛應用[2]。八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素生物合成過程中催化無色的八氫番茄紅素形成有色的一類胡蘿卜素的關鍵酶，沉默PDS基因后植物出現(xiàn)白化或者光漂白癥狀，Kumagai等[3]第一次將八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）克隆到煙草花葉病毒（TMV）中，利用病毒誘導基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技術浸染煙草后植株表現(xiàn)白化表型，隨后在擬南芥、煙草、番茄等多種植物上得到成功應用，PDS是目前植物分子生物學研究中應用最廣泛的內源報告基因[4]。

細胞周期蛋白C1 （Fusarium cyclin C1，F(xiàn)CC1）2001年在輪枝鐮刀菌（F. verticillioides）上首次被發(fā)現(xiàn)，參與次生代謝產(chǎn)物伏馬菌素FB1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）的生物合成以及孢子形成[5]。水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）中FCC1基因敲除突變體出現(xiàn)紅色或紫色菌落表型，與野生型的白色菌落表型差異明顯，可作為內源報告基因評估基因敲除的效率[6]。通過生物信息學功能域分析軟件SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http：//smart.embl.de）分析了Foc4菌株含有Cyclin Box功能域的FCC1同源基因FocFCC1（FOIG_04434），并以此為靶標基因開展基因敲除及表型分析，驗證FocFCC1基因缺失突變體是否出現(xiàn)典型的紅色菌落，用以確定FocFCC1可以用作Foc內源報告基因。然后以FocFCC1為內源報告基因，對比分析了2種主要的基因敲除重組技術：Split-marker重組方法（Split-marker re-combination approach）[7]和多片段裝配融合方法（Multi-fragment assembly by In-Fusion cloning）[8-9]構建的重組片段介導的基因敲除效率，證實FocFCC1作為內源報告基因的可行性，并為后續(xù)開發(fā)新的適合香蕉枯萎菌分子生物學研究的遺傳操作效率評估提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗菌株及香蕉品種 ?香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)oc4），由實驗室鑒定保存。試驗接種的香蕉品種為巴西蕉（Cavendish cv. Brazil，AAA）。

1.1.2 ?試驗試劑 ?Taq DNA 聚合酶、LA Taq DNA高保真酶等購自大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（HPLC純化），其他試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司

1.2 ?方法

1.2.1 ?真菌DNA的制備 ?采用CTAB方法提取真菌的基因組DNA。將實驗室保存的Foc4野生型菌株接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d后，刮取新鮮的菌絲，按照CTAB方法提取菌絲DNA。其他突變體的DNA提取按照Foc4的操作進行。

1.2.2 ?FCC1蛋白結構域分析及基因敲除片段擴增 ?利用在線蛋白功能域預測分析軟件SMART分析FocFCC1的功能域。參考FocFCC1的基因序列（FOIG_04434）和已發(fā)布的Foc4野生株基因組序列（JH658279.1），設計引物LBCK和LB- R，RB-F和RBCK（表1）擴增FocFCC1基因的上下游片段;設計NEO-F和NEO-R引物（表1）擴增新霉素片段;重組上下游片段則分別通過引物LB-F/NEO-R1和NEO-F1/RB-R（表1）來擴增。Outside引物檢測靶標基因是否被重組片段替換，而Inside引物檢測FocFCC1內源基因。

1.2.3 ?原生質體制備及轉化 ?香蕉枯萎菌原生質體制備參照王飛燕等[10]的方法進行。PEG介導的原生質體轉化參照徐齊君等[11]的方法。以培養(yǎng)3 d的Foc4野生株為原始菌株制備濃度為1×107個/mL的原生質體，參考戴蓬博等[12]的方法，分別取3～ 5 μg上下游片段回收產(chǎn)物與1 mL原生質體混勻，冰上放置30 min后;取2 mL 60% PTC分3次緩慢加入到混合液后，冰上放置15～20 min;將預冷的STC溶液加入到混合液至25 mL，4 ℃，5000 r/min離心15 min后去上清液;加入無抗性的SR液體培養(yǎng)基3 mL后，再加入含有200 μg/mL新霉素和50 μg/mL鏈霉素的SR固體培養(yǎng)基混勻后均勻倒在培養(yǎng)皿上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后得到轉化子，并連續(xù)培養(yǎng)3代得到穩(wěn)定轉化子。

1.2.4 ?ΔFocFCC1的PCR鑒定 ?采用CTAB方法提取真菌的基因組DNA。配制20 μL PCR反應體系，反應程序：94 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，58 ℃ ?45 s，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，16 ℃ 5 min，35個循環(huán)擴增驗證敲除體中的目標片段，其中引物Outside- F/Outside-R檢測靶標基因是否敲除;而引物Inside- F/Inside-R對敲除體內源基因進行檢測（表1）。

1.2.5 ?ΔFocFCC1生長特性分析 ?（1）生長形態(tài)和生長速率測定：挑選3個培養(yǎng)3～5 d的新鮮穩(wěn)定轉化子和Foc4野生株，分別取5 mm菌餅分別接種到無抗性的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，并分別在培養(yǎng)1、3、5、7 d測量菌落直徑并拍表型圖，每次設置3個重復。第7天觀察結束后從PDA平板上取少量菌絲，制成載玻片進行顯微形態(tài)觀察。

（2）產(chǎn)孢量分析：取ΔFocFCC1和Foc4野生株的5 mm新鮮菌餅分別加入到無抗性PDB中，28 ℃搖床搖培7 d，三層濾紙過濾后分生孢子借助血球計數(shù)板在顯微鏡觀察并統(tǒng)計其孢子數(shù)量。

1.2.6 ?ΔFocFCC1致病力分析 ?取ΔFocFCC1和Foc4野生株的5 mm新鮮菌餅分別接種到100 mL PDB（無抗性）中，搖床28 ℃、150 r/min搖培5 d，用三層濾紙將菌絲過濾，收集分生孢子液，用無菌水將分生孢子液濃度調節(jié)到2×106個/mL。采用盆栽傷根灌淋法測定菌株致病性。其中突變體和野生株分別處理15株蕉苗，每株苗澆灌15 mL孢子液，以無菌水作為空白對照，3次重復，60 d后縱向切開蕉苗球莖，觀察球莖褐變程度，參考陸小平等[13]的病情調查分級標準，記錄每株苗的發(fā)病等級并對病情指數(shù)進行統(tǒng)計。

1.2.7 ?評估2種基因敲除重組方法構建的重組片段介導的基因敲除效率 ?以FocFCC1為報告基因評估2種敲除重組DNA方法的敲除效率。

（1）Split-marker重組方法：參考Wang等[7]的方法構建Split-marker基因敲除重組片段，包含2個重組DNA片段，具體分兩步進行。第一輪PCR擴增3個片段：NEO-F/NEO-R擴增NEO抗性基因1.4 kb;Foc4基因組DNA為模板，引物FCC1-NEO-LBCK/FCC1-NEO-LB-R擴增左端LB1（2084 bp）;Foc4基因組DNA為模板，引物

FCC1-NEO-RB-F/FCC1-NEO-RBCK擴增右端RB1 （2036 bp）。第二輪PCR擴增2個重組DNA片段：左端（5上游）重組DNA片段擴增（LB2+NE）：FCC1-NEO-LB-F/NEO-R1為引物，F(xiàn)CC1-LB1+ NEO-1.4 kb為模板，擴增產(chǎn)物大小2398 bp;右端（3下游）重組DNA片段擴增（EO+RB2）：NEO-F1/FCC1-NEO-RB-R為引物，NEO-1.4 kb+ FCC1-RB1為模板，擴增產(chǎn)物2606 bp。將5上游重組DNA和3下游重組DNA等體積混合后按照上述的原生質體轉化方法進行轉化。

（2）多片段裝配融合方法重組方法：參考Zhu 等[8]、Raman等[9]的方法構建多片段組裝、融合標記的敲除重組DNA片段。將上述Split Marker構建的2個重組DNA片段，5上游重組DNA片段（LB2+NE）、3下游重組DNA片段（EO+RB2），當做PCR模板混合，引物FCC1-NEO-LB-F/ FCC1-NEO-RB-R進行joint-PCR擴增，得到一條多片段組裝、標記融合的重組DNA片段。將得到的一條多片段組裝、標記融合的重組DNA片段

（3～5 μg）按照上述的原生質體轉化方法進行轉化。利用紅色菌落表型作為判斷依據(jù)，挑取再生板上有紅色菌落表型的轉化子進行PCR檢測，分別統(tǒng)計2種重組方法獲得的陽性轉化子的占比，評估2種基因敲除重組方法構建的重組片段介導的基因敲除效率。

2 ?結果與分析

2.1 ?FCC1蛋白結構域分析及敲除突變體鑒定

利用在線SMART軟件分析FCC1蛋白功能域，結果顯示，香蕉枯萎病菌FocFCC1與水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）、玉米穗腐病菌（F. verticillioides）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）以及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等含有相同的蛋白功能域，除了含有典型的細胞周期蛋白表達框（Cyclin BOX）外，還含有RQKL功能域（the destruction box- like motif）、PEST-Rrich功能域（圖1A、圖1B）。

A：SMART預測的香蕉枯萎菌FocFCC1蛋白保守結構域。蛋白序列登錄號為：FocFCC1，香蕉枯萎菌4號小種（EXM06030.1，本研究）;FvFCC1，玉米穗腐病菌（AAK30047.1）;FfFCC1，稻惡苗病菌（SCN64880.1）;NcFCC1，粗糙脈孢菌（CAC18151.1）;ScUME3，釀酒酵母（NP_014373.3）。B：FCC1蛋白氨基酸多序列比對。黑框所示位置為RQKL和PEST-rich結構域，實線所示位置為Cyclin Box結構域。

A： Schematic representation of the conserved domain of FocFCC1 by using SMART. Accession No.： FocFCC1， F. oxysporum f. sp. cubense race 4 （EXM06030.1， this study）; FvFCC1， F. verticillioides （AAK30047.1）; FfFCC1， F. fujikuroi （SCN64880.1）; NcFCC1， Neurospora crassa （CAC18151.1）; ScUME3， Saccharomyces cerevisiae S288C （NP_014373.3）. B： Multiple alignment of FCC1. Black boxes indicate the region of RQKL and PEST-rich， respectively. Solid line indicates the region of Cyclin Box.

提取ΔFocFCC1和野生株Foc4的基因組DNA，作為PCR擴增模板驗證陽性轉化子，分別用Outside-F/Outside-R、Inside-F/Inside-R對這2對引物進行擴增。陽性敲除轉化子Outside-F/ Outside-R引物擴增出1927 bp的重組片段，F(xiàn)oc4野生型擴增出1575 bp的FocFCC1基因組片段。Inside-F/Inside-R從Foc4野生型DNA中擴增出679 bp內源片段，陽性轉化子無條帶（圖2B）。

2.2 ?ΔFocFCC1生長特性分析

將Foc4和ΔFocFCC1接種于PDA培養(yǎng)基上，經(jīng)過7 d的定期測量菌落直徑大小，結果顯示，ΔFocFCC1菌落呈現(xiàn)紅色，F(xiàn)oc4野生株菌落無色素產(chǎn)生，菌落無色，PDB搖培7 d，同樣觀察到ΔFocFCC1發(fā)酵液呈現(xiàn)紅色（圖2A），ΔFocFCC1氣生菌絲減少，菌落平滑，而野生菌株Foc4氣生菌絲多，菌落絨毛狀。ΔFocFCC1生長速度慢于野生株Foc4，其菌落直徑為4.9 cm，野生株Foc4菌落直徑7.5 cm，二者差異顯著（圖3A、圖3B）。

2.3 ?ΔFocFCC1菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢量分析

顯微觀察結果顯示，與野生株對比，突變體的菌絲呈現(xiàn)不規(guī)則扭曲，不規(guī)則分支增多，且分支處呈現(xiàn)弧狀，而不是Foc4典型的角狀。ΔFocFCC1菌絲分叉多，節(jié)間縮短，菌絲膨大皺縮，出現(xiàn)典型的膨大球狀體結構（圖4）。

PDB搖培7 d后，ΔFocFCC1分生孢子形態(tài)和大小發(fā)生改變，野生菌株Foc4小型分生孢子卵圓形或腎型，無色，單胞或雙胞，而ΔFocFCC1分生孢子長度變短，寬度變寬，卵圓形或近球形（圖5A）。ΔFocFCC1分生孢子平均大小為（6.19± 0.33） μm×（3.28±0.05） μm，F(xiàn)oc4分生孢子平均大小為（7.29±0.58） μm×（2.57±0.09） μm（圖5C）。統(tǒng)計其產(chǎn)孢量，結果顯示，ΔFocFCC1產(chǎn)孢量為（3.5±0.93）×107個/mL，野生株Foc4產(chǎn)孢量為（15.5±2.58）×107個/mL，ΔFocFCC1產(chǎn)孢量顯著降低（圖5B）。

A：ΔFocFCC1分生孢子形態(tài);B： ΔFocFCC1產(chǎn)孢量;C：ΔFocFCC1分生孢子大小。不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

A： Microscopic observe the conidia morphology between Foc4 and ΔFocFCC1 cultured from PDB; B： The number of conidia production between Foc4 and ΔFocFCC1，; C： The shape of conidia between Foc4 and ΔFocFCC1. Different lowercase letters indicate significant differences （P<0.05）.

2.4 ?ΔFocFCC1致病力分析

將Foc4野生株和ΔFocFCC1的孢子懸液分別接種到健康巴西蕉苗，60 d后觀察接種的巴西蕉苗的葉片癥狀以及球莖褐化情況。以H2O作為空白對照的巴西蕉苗葉片嫩綠，葉片無病狀出現(xiàn)，球莖無褐化現(xiàn)象。Foc4野生株接種的蕉苗葉片出現(xiàn)嚴重黃化甚至枯萎，球莖褐化明顯;ΔFocFCC1接種的香蕉苗葉片輕微黃化，球莖也出現(xiàn)輕微褐化（圖6A）。

統(tǒng)計發(fā)病植株的病情指數(shù)結果顯示，F(xiàn)oc4野生株為74.5%，ΔFocFCC1為46.9%，雖然ΔFocFCC1的致病力顯著下降，但是突變體仍然能夠致病且球莖褐化，并未完全喪失致病力（圖6B）

A：Foc4野生株和ΔFocFCC1侵染巴西蕉的球莖癥狀，水作為對照;B：Foc4野生株和ΔFocFCC1侵染巴西蕉苗的病情指數(shù)統(tǒng)計。不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

A： The corm phenotype of banana inoculated by Foc4 and ΔFocFCC1， H2O inoculation used as control; B： The disease indexes of the banana infected by Foc4 and ΔFocFCC1， respectively.

2.5 ?評估2種基因敲除重組方法構建的重組片段介導的基因敲除效率

2.5.1 ?Split-marker重組方法介導的基因敲除 ?Split- marker重組方法的示意圖如圖7A，為了評估重組片段介導的基因敲除效率，通過PEG4000原生質體轉化子將所有具有紅色表型轉化子挑取后在抗性PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖7B），CTAB法提取基因組DNA后分別用Outside和Inside引物檢測所有轉化子，結果顯示12個轉化子中，有11個轉化子是陽性轉化子，獲得陽性轉化子的比例為91.7%。

2.5.2 ?多片段裝配融合方法介導的敲除效率 ?多片段裝配融合方法的示意圖如圖8A，原生質體轉化子將所有具有紅色菌落表型的轉化子挑取后在抗性PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖8B），CTAB法提取基因組DNA后分別用Outside和Inside引物檢測所有轉化子，結果顯示14個轉化子中，有9個轉化子是陽性轉化子，獲得陽性轉化子的比例為64%。

雖然2種重組方法獲得陽性轉化子比例存在差異，但是值得注意的是，所有陽性ΔFocFCC1突變體都出現(xiàn)紅褐色的菌落表型，與PCR檢測結果一致，這些結果說明ΔFocFCC1表型可以輔助陽性轉化子的篩選。

3 ?討論

香蕉枯萎菌FocFCC1含有典型的細胞周期蛋白表達框（Cyclin BOX）外，還含有RQKL功能域、PEST-Rrich功能域，與其他真菌FCC1蛋白序列高度同源。敲除FocFCC1基因后菌株生長緩慢，產(chǎn)孢量下降，致病力下降，菌落出現(xiàn)典型紅色或紅褐色表型，與F. fujikuroi上的報道結果一致[6]，這些結果說明FCC1在進化過程中具有高度的序列和功能保守性，F(xiàn)CC1符合作為內源報告基因的條件：（1）全序列已測定且為單一拷貝基因;（2）重復性好、表型明確且容易分辨，菌落出現(xiàn)與野生株差異明顯的紅色表型;（3）其表達產(chǎn)物能夠進行定量測定，F(xiàn)CC1調控伏馬菌素（fumonisin）的生物合成，伏馬菌素的含量與致病力一致[6]。

基因敲除是研究基因功能的手段之一，利用同源重組基因敲除，即利用基因兩側的同源臂在位點特異性DNA重組酶的作用下進行基因敲除是香蕉枯萎菌最常用的方法。構建基因敲除重組片段有2種方式，一種是Split-marker重組技術，將篩選標記基因分割到上、下游的同源臂序列上，轉化后在體內可以再次重組交換，提高敲除的陽性率;另外一種是Multi-fragment assembly融合方法，通過In-Fusion cloning技術將上、下游同源臂序列和篩選標記基因等多片段融合的重組DNA片段。以FCC1為內源報告基因，評估這2種基因敲除重組片段介導的基因敲除效率。試驗中，盡可能地挑取了所有的紅色菌落表型的轉化子進行檢測分析減少誤差。結果顯示，二者再生板上的轉化子數(shù)量差異不明顯，Split-marker重組技術的陽性轉化子比例為91.7%，而Multi- fragment assembly融合構建方法的陽性轉化子比例達到了64%。此外，通過紅色菌落表型和PCR條帶一一對應分析，出現(xiàn)紅色菌落表型的都是陽性轉化子，也就是說，通過紅色菌落表型即可輔助篩選判斷陽性轉化子，節(jié)省后續(xù)DNA提取以及PCR擴增電泳等諸多步驟和時間。

綜上，F(xiàn)ocFCC1基因在Foc4的生長發(fā)育、產(chǎn)孢及致病力等方面具有重要的作用。FocFCC1作為香蕉枯萎菌的內源報告基因，通過表型即可判斷陽性轉化子，為后續(xù)其他分子生物學技術的探索和建立提供了良好的靶標選擇。

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責任編輯：沈德發(fā)