姜 鯤,尹義江,陳峙峰,鄧旭明,呂強(qiáng)華*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林省牧業(yè)信息中心，吉林 長春130062；3.吉林省牧碩養(yǎng)殖有限公司，吉林 長春130062；4.吉林市豐滿區(qū)小白山鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林 吉林市 132000)

1885年美國獸醫(yī)學(xué)家丹尼爾·埃爾蒙·薩蒙和希爾博得·史密斯首次發(fā)現(xiàn)沙門菌，并命名為沙門菌屬[1]。沙門菌(Salmonella)是一種兼性厭氧革蘭陰性菌，在自然界廣泛分布，目前經(jīng)鑒定的血清型超過2 600種，我國報(bào)道已有292個(gè)血清型[2]。沙門菌感染畜禽引起不同的臨床表現(xiàn)，可導(dǎo)致自限性胃腸炎、傷寒、副傷寒和系統(tǒng)性感染等疾病[3]，對養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來，歐洲食品安全局報(bào)道在人類食源性疾病的各種誘因中沙門菌的危害已躍居第二位。在我國，沙門菌引發(fā)食物中毒的事件更是屢見不鮮，嚴(yán)重威脅人類的生命安全[4]。沙門菌作為一種人畜共患病原菌造成的危害已經(jīng)不容忽視，迫切需要有效的方法和手段解決面臨的難題。

畜禽生產(chǎn)中主要依靠抗生素治療沙門菌感染，但抗生素的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性逐年增強(qiáng)和耐藥譜逐漸加寬，常規(guī)抗生素的治療效果已經(jīng)陷入困境。因此，尋求新型抗菌藥物或抗菌策略對抗耐藥菌的感染迫在眉睫。研究表明，沙門菌的致病性主要依賴于2個(gè)毒力島(SPIs，Salmonellapathogenicity islands)及其編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)[5]。SPI-1編碼的T3SS通過將效應(yīng)蛋白注射至宿主細(xì)胞，在入侵腸上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，而SPI-2編碼的T3SS調(diào)控細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活、復(fù)制和增殖[6]。相比常規(guī)抗生素直接殺傷或殺滅病原菌的作用機(jī)制，以細(xì)菌生命過程非必需成分(如沙門菌T3SS)為靶標(biāo)的抗毒力療法成為一種理想的藥物研發(fā)策略。

丁香是一味古老的中藥，其根、莖、葉、花和果都可入藥，在藥學(xué)領(lǐng)域中被廣泛研究，具有清熱燥濕、解毒、消炎、利濕退黃的作用[7-9]。在本研究中，通過制備的丁香油口服液，發(fā)現(xiàn)丁香油口服液抑制沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，通過抗菌活性測定、蛋白免疫印跡(Western blot)和熒光定量PCR等研究丁香油口服液抑制沙門菌T3SS功能的作用機(jī)制，并評價(jià)丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的保護(hù)效果，旨在為丁香油口服液治療沙門菌感染的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，以期為抗沙門菌感染提供候選制劑。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞與試劑雞白痢沙門菌CVCC1789購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；抗ICDH血清由美國普渡大學(xué)羅招慶教授饋贈；人宮頸癌細(xì)胞HeLa來源于北京協(xié)和細(xì)胞中心；丁香油口服液(規(guī)格：100 mL/瓶，丁香酚含量不低于80 g/L)，由吉林大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取和制備；空白輔料(規(guī)格：含二丁基羥基甲苯0.1 g,檸檬酸0.2 g,聚山梨酯-80為50 g，乙醇150 mL，PEG400加至1 L)；硫酸新霉素由河南新正好生物工程有限公司生產(chǎn)(規(guī)格：100 g∶5 g，500萬單位)；TSB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；含報(bào)告質(zhì)粒sipA-PEX233菌株購自美國Abcam公司；6×CCF4試劑和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司。

1.2 試驗(yàn)動物1日齡AA+肉雛雞購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，正常飼喂至5日齡備用。

1.3 主要儀器生物安全柜(HDL)，購自哈東聯(lián)有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82)，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電子天平(BSA124S/224S-CW)，購自德國賽多利斯；組織研磨儀，購自上海凈信生物科技有限公司；免疫熒光顯微鏡，購自日本奧林巴斯；電泳儀、垂直蛋白電泳槽和半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，購自美國Bio-Rad；Tanon 4200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；普通光學(xué)顯微鏡、手術(shù)刀、眼科鑷和眼科剪等。

1.4 丁香油口服液對沙門菌T3SS抑制作用

1.4.1HeLa細(xì)胞的培養(yǎng) 將液氮中凍存的HeLa細(xì)胞放置在37℃水浴鍋中快速融化。1 000 r/min離心5 min后棄上清，使用含有10%胎牛血清和1×雙抗(青霉素/鏈霉素)溶液的DMEM高糖完全培養(yǎng)基輕柔重懸，將懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，向瓶中補(bǔ)充4 mL完全培養(yǎng)基混合均勻，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，5% CO2條件下培養(yǎng)。待瓶底細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4.2細(xì)胞感染 按1.5×104個(gè)/孔將HeLa細(xì)胞接種于96孔板，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)16～18 h。含報(bào)告質(zhì)粒的沙門菌CVCC1789::SipA-TEM于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)，加入終質(zhì)量濃度為200 mg/L丁香油口服液或等量空白輔料，置于37℃和200 r/min水平搖床繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(D600 nm=1.0左右)。1 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS清洗3次，制備菌懸液。按細(xì)菌∶細(xì)胞=50∶1的比例感染HeLa細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后靜置于37℃培養(yǎng)箱孵育90 min。吸出96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入CCF4工作試劑100 μL，室溫避光孵育45 min 后，在熒光顯微鏡下觀察不同處理組細(xì)胞的熒光(藍(lán)色或綠色)情況。

1.5 丁香油口服液對體外抗菌活性測定

1.5.1最小抑菌濃度(MIC)的測定 根據(jù)CLSI(Clinical And Laboratory Standards Institute)公布的標(biāo)準(zhǔn)方法M7-A8，測定丁香油口服液對沙門菌的MIC。將雞白痢沙門菌 CVCC1789接種至2 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜待用，用新鮮LB培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至5×105CFU/mL，隨后加入不同質(zhì)量濃度的丁香油口服液倍比稀釋，使其終質(zhì)量濃度為0，4，8，16，32，64，128，256，512，1 024 mg/L，每孔體系為100 μL，另設(shè)LB純培養(yǎng)基陰性對照組和不加丁香油口服液的陽性對照組，37℃靜置培養(yǎng)24 h，以無細(xì)菌生長的最低藥物質(zhì)量濃度作為丁香油口服液的MIC。

1.5.2丁香油口服液對沙門菌生長曲線的測定 將過夜培養(yǎng)的CVCC1789按1∶50擴(kuò)培于100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm=0.3。將菌液等量分裝到5個(gè)50 mL的三角錐形瓶中，同時(shí)加入不同質(zhì)量濃度的丁香油口服液(終質(zhì)量濃度分別為0，25，50，100，200 mg/L。置于37℃、200 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔1 h測定菌液的D600 nm值并記錄，繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.6 丁香油口服液對沙門菌T3SS的作用機(jī)制

1.6.1Western blot檢測沙門菌T3SS主要效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)的表達(dá) 沙門菌CVCC1789于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)過夜培養(yǎng)，次日按1∶100擴(kuò)培，加入丁香油口服液(終質(zhì)量濃度為200 mg/L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，10 000 r/min離心5 min 收集菌體，加入100 μL 1×loading buffer(含β-巰基乙醇)重懸菌體，置于100℃水浴鍋中煮沸6 min。取上述樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用半干式轉(zhuǎn)膜儀將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。使用沙門菌SipA抗血清(鼠來源)、沙門菌SipB抗血清(鼠來源)、HilA抗血清(鼠來源)和 ICDH 抗血清(兔來源)分別常溫孵育2 h 后，羊抗鼠或羊抗兔常溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，置于Tanon 4200顯影儀采集圖像。

1.6.2RT-PCR法檢測沙門菌SPI-1基因 本研究參照基因組序列信息詳細(xì)的鼠傷寒沙門菌SL1344進(jìn)行檢測。挑沙門菌CVCC1789單菌落于LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日1∶20擴(kuò)培，加入終質(zhì)量濃度分別為0,200 mg/L的丁香油口服液，37℃培養(yǎng)4 h。使用Trizol法提取細(xì)菌總RNA，進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄，使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測和分析。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，序列如下：

sipA-F 5′-GTCATTCGCGTGTGGATTCG-3′，sipA-R 5′-TTCGGATGAAGCGTTGGTCA-3′；

sipB-F 5′-GGGCAGATGATACCCGATGG-3′，sipB-R 5′-AAGAGAGAAGCGGGTTGGTG-3′；

hilA-F 5′-AAGAAGCGACAGAGGCGAAA-3′，hilA-R 5′-TATCCTGCTCACCCTGGGAA-3′；

FliC-F 5′-CGGAAGCGGCTGCTACAAC-3′，F(xiàn)liC-R 5′-CGGCTACGGGCAGAAGTCA-3′；

FliC作為內(nèi)參基因。

1.7 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的治療作用

1.7.1分組與處理 將肉雛雞隨機(jī)分組，每組20只。分組及處理方法見表1。

表1 試驗(yàn)動物分組及處理方法

1.7.2判定指標(biāo) 分別于給藥后3，7,12 d觀察并記錄各組雛雞臨床癥狀。雞沙門菌病臨床癥狀為精神萎頓、拉白色漿糊狀稀糞及糊肛等。

分別于給藥后3,7 d隨機(jī)抽取5只及給藥后12 d 剖檢剩余所有雛雞，觀察肝臟、脾臟和盲腸病理變化。典型病理變化：肝臟外觀呈土黃色，出現(xiàn)針尖大出血點(diǎn)和灰白色的壞死灶，質(zhì)地脆弱；脾臟呈現(xiàn)紅褐色，腫脹，有出血點(diǎn)(斑)；盲腸出現(xiàn)一定程度的積糞。

給藥前各組全部雛雞(20只/組)和給藥后12 d各組剩余雛雞(10只/組)分別稱體質(zhì)量，以健康對照組增重率為100%計(jì)，計(jì)算平均增重和相對增重率。

臨床癥狀和病理變化作為療效判定主要指標(biāo)，體質(zhì)量變化情況作為次要指標(biāo)。

治愈：治療后臨床癥狀和病理變化消失，判定治愈。

有效：治療后臨床癥狀和病理變化顯著緩解，判定有效。

無效：臨床癥狀和病理變化未顯著緩解，判定無效。

治愈率=(組內(nèi)治愈數(shù)/組內(nèi)總數(shù))×100%

有效率=(組內(nèi)有效數(shù)/組內(nèi)總數(shù))×100%

總有效率=治愈率+有效率

無效率=(組內(nèi)無效數(shù)/組內(nèi)總數(shù))×100%

2 結(jié)果

2.1 丁香油口服液抑制沙門菌T3SS的功能如圖1所示，含報(bào)告質(zhì)粒PEX233-SipA的CVCC1789::SipA-TEM菌株感染HeLa細(xì)胞后絕大多細(xì)胞呈藍(lán)色熒光；空白輔料對照組大多細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；200 mg/L丁香油口服液組大多數(shù)細(xì)胞呈綠色熒光，說明丁香油口服液阻止沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白SipA轉(zhuǎn)運(yùn)至HeLa細(xì)胞，抑制沙門菌T3SS的功能。

圖1 丁香油口服液對沙門菌T3SS功能的抑制作用

注：感染組，CVCC1789::SipA-TEM感染；感染+丁香油口服液組，200 mg/L丁香油口服液預(yù)處理CVCC1789::SipA-TEM后感染；感染+空白輔料組，空白輔料預(yù)處理CVCC1789::SipA-TEM后感染。藍(lán)色熒光代表沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白SipA正常轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞；綠色熒光代表沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白SipA不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞。

2.2 丁香油口服液對沙門菌無抗菌活性如圖2所示，不同質(zhì)量濃度的丁香油口服液處理組沙門菌CVCC1789的生長曲線與對照組相似，說明丁香油口服液對沙門菌的生長無顯著性影響；同時(shí)，丁香油口服液對沙門菌CVCC1789的MIC值大于1 024 mg/L，該結(jié)果表明丁香油口服液對沙門菌無抗菌活性。

圖2 丁香油口服液對沙門菌生長的影響

2.3 丁香油口服液降低沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)及調(diào)控蛋白(HilA)的表達(dá)通過Western blot檢測丁香油口服液對沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)表達(dá)的影響。由圖3可知，相比對照組，質(zhì)量濃度為200 mg/L的丁香油口服液抑制沙門菌CVCC1789 T3SS主要效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)的表達(dá)。

圖3 丁香油口服液對沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白和調(diào)控蛋白的影響

2.4 丁香油口服液抑制沙門菌SPI-1相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄上述研究表明丁香油口服液抑制沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)的表達(dá)。為進(jìn)一步研究丁香油口服液的作用機(jī)制，通過熒光定量PCR測定丁香油口服液對沙門菌SPI-1相關(guān)基因(sipA、sipB和hilA)轉(zhuǎn)錄的影響。由圖4可知，質(zhì)量濃度為200 mg/L的丁香油口服液顯著降低上述基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。

圖4 丁香油口服液對沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白及調(diào)控蛋白基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

2.5 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的治療作用

2.5.1臨床癥狀 健康對照組未出現(xiàn)異常，試驗(yàn)過程未發(fā)生沙門菌感染；感染對照組和空白輔料對照組，給藥后7，12 d所有雛雞表現(xiàn)精神萎頓和拉白色稀糞的臨床癥狀，表明感染模型建立成功(圖5)，空白輔料對雞沙門菌病無任何療效。由表2可知，給藥后12 d丁香油口服液不同劑量組和硫酸新霉素對照組分別有45%，40%，30%，30%的雛雞呈現(xiàn)臨床癥狀，表明丁香油口服液和硫酸新霉素均可緩解感染雛雞的臨床癥狀，且中劑量和高劑量組與硫酸新霉素組臨床癥狀相近。

圖5 發(fā)病雞臨床癥狀

表2 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的臨床癥狀觀察 %

2.5.2病理變化 如表3所示，健康對照組未出現(xiàn)異常變化，說明飼養(yǎng)過程中未發(fā)生感染；感染對照組和空白輔料組雛雞肝臟呈現(xiàn)不同程度淤血，脾臟腫大和盲腸積糞等典型病變，說明感染模型成功建立，空白輔料對雞沙門菌病無任何治療作用(圖6)。丁香油口服液不同劑量和硫酸新霉素對照組在給藥后呈現(xiàn)病理變化的雛雞數(shù)量逐漸減少，低劑量組療效較差，中劑量和高劑量與硫酸新霉素療效相近。

圖6 給藥后12 d各組剖檢病理變化

表3 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的病理變化觀察 %

2.5.3體質(zhì)量變化 如表4所示，健康對照組、感染對照組、丁香油口服液不同劑量組、硫酸新霉素對照組和空白輔料組平均增重分別為 653.76，457.58，576.40，620.43，624.46，628.96，465.84 g；以健康對照組增重率為100.00%計(jì)，感染對照組、丁香油口服液組、硫酸新霉素對照組和空白輔料對照組的相對增重率分別為69.99%，88.17%，94.90%，95.52%，96.21%，71.26%，感染對照組和空白輔料對照組相對增重率較低；中劑量和高劑量組平均增重和相對增重率與硫酸新霉素對照組相近，表明丁香油口服液可有效緩解沙門菌感染所造成體質(zhì)量下降趨勢。

表4 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病體質(zhì)量變化統(tǒng)計(jì) g

2.5.4治療效果統(tǒng)計(jì) 由表5可知，丁香油口服液不同劑量組和硫酸新霉素對照組治愈率分別為45%，60%，65%，70%，總有效率分別為65%，80%，85%，90%，表明丁香油口服液中劑量對雞沙門菌感染具有良好治療作用，與硫酸新霉素療效相當(dāng)。

表5 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病治療試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 %

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)沙門菌以來，作為一種臨床上常見人畜共患病原菌，沙門菌病仍是困擾人類和動物的一種多發(fā)性疾病[10]。尤其在一些國家和地區(qū)，沙門菌已經(jīng)成為食源性高致病菌，具有高傳染率和高傳播率的特點(diǎn)[11]。隨著生活水平的提高和環(huán)保意識的增強(qiáng)，人們對食品安全和環(huán)保問題的要求越來越高，加上如今規(guī)模化和集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，選擇健康有效的抗菌藥物和抗菌策略防治畜禽沙門菌感染，對于促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和提供健康安全的畜禽產(chǎn)品至關(guān)重要。

相比于傳統(tǒng)抗生素通過抑制細(xì)菌必需成分易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，以細(xì)菌生命過程非必需成分(如溶血素、菌毛、鞭毛和Ⅲ型分泌系統(tǒng))為靶標(biāo)的抗毒力藥物研發(fā)已成為人類關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來，已有許多以細(xì)菌致病過程的毒力因子為靶標(biāo)的化合物和天然小分子抑制劑陸續(xù)被報(bào)道出來[12-15]。在我國，中藥的應(yīng)用歷史悠久，為抗細(xì)菌感染新藥研發(fā)提供了巨大的天然寶庫[16-18]?；谥兴幥鍩峤舛镜裙πУ呐R床實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)中藥抗感染是以細(xì)菌致病過程的毒力因子為靶標(biāo)的作用機(jī)制，來源廣泛、成本低廉和綠色環(huán)保的中藥成為抗細(xì)菌毒力策略中藥物研發(fā)的理想選擇。

在本研究中，通過建立沙門菌T3SS抑制劑的篩選平臺，發(fā)現(xiàn)丁香油口服液顯著抑制沙門菌T3SS的功能，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。同時(shí)，建立人工感染雞沙門菌病模型并對丁香油口服液的治療效果進(jìn)行評價(jià)，以臨床癥狀、病理損傷及體質(zhì)量情況等指標(biāo)評價(jià)丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的保護(hù)效果。結(jié)果表明，丁香油口服液通過抑制沙門菌SPI-1相關(guān)編碼基因(sipA、sipB和hilA)的轉(zhuǎn)錄，降低效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)節(jié)蛋白(HilA)表達(dá)抑制沙門菌T3SS功能的作用機(jī)制；體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丁香油口服液有效降低感染肉雞的病理損傷，減輕臨床癥狀和緩解體質(zhì)量下降趨勢，顯著提高感染肉雞的治愈率和有效率。綜上所述，丁香油口服液是一種治療沙門菌感染的潛在制劑，該研究也為它的臨床開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。